Služby mikroinjekce DNA

  • pozadí
  • objednání
  • časy obratu
  • záruky výkonu
  • popis služby
  • úvahy o kmeni myší
  • chov transgenních zakladatelů

pozadí

od roku 1980 byly transgenní myši rutinně generovány injekcí roztoku DNA do pronukleusu oplodněného vajíčka. V podílu injikovaných vajec se DNA integruje do jednoho z chromozomů. Buňky sestupující z tohoto oplodněného vajíčka, včetně zárodečných buněk, mohou obsahovat transgenovou DNA. Myši s transgenem mohou být chovány a analyzovány za účelem zkoumání účinku transgenu na vývoj myší, reprodukci nebo homeostázu.

myši jsou pro tento postup zvláště vhodné, protože je snadné sbírat velké množství oplodněných vajec od relativně malého počtu zvířat. K produkci vajec dostávají dárci vajíček dvě hormonální injekce s odstupem 46-48 hodin. Tento proces (nazývaný superovulace) způsobuje, že uvolňují více než obvyklý počet vajec a stávají se vnímavými k páření. Superovulované samice myší jsou pářeny s plodnými samci myší a vejce jsou sklizena příští ráno.

mikroinjekce DNA se provádí krátce po oplodnění. Pronuklei myších vajec jsou snadno vizualizovány pomocí optiky diferenciálního interferenčního kontrastu (DIC) (viz obrázek vpravo). Oplodněná vejce mají dvě pronuklei, jednu z každé gamety. Injikovaná DNA se může integrovat do chromozomů v injikovaném pronukleu během replikace chromozomů. Poté, co se DNA v každém pronukleu duplikovala, pronukleární obálky se rozpadají, duplikované chromozomy se vyrovnají na metafázové destičce a oplodněný oocyt se rozdělí a vytvoří dvoubuněčné embryo myši.

po injekci DNA jsou přežívající oplodněná vajíčka chirurgicky přenesena do vajíček pseudopregnantních myší. Pseudopregnantní myši jsou produkovány pářením plodných samic s vazektomizovanými samci. Protože jsou samci sterilní, samice neprodukují vlastní oplodněná embrya. Proces páření však stimuluje jejich reprodukční trakt, aby podpořil vývoj oplodněných vajíček po chirurgickém přenosu. Pokud se injikovaná DNA integrovala do chromozomu, potomci vyplývající z přenosu injikovaných vajíček by měli obsahovat transgen v některých nebo všech buňkách v jejich těle.

po narození mláďat myší se získá malá tkáňová biopsie a DNA se extrahuje a analyzuje na přítomnost transgenu. V průměru asi 15-20% myší, které jsme vyrobili z mikroinjekce DNA, bylo pozitivně testováno na transgen. Počáteční myši, které nesou transgen, se nazývají „zakladatelská“ (nebo F0) transgenní zvířata. F0 myši jsou následně pářeny s divokými myší typu identifikovat F1 potomstvo obsahující transgen a nové linie (kmeny) transgenních myší jsou stanoveny.

ačkoli je tento způsob produkce transgenních myší populární, má některé nevýhody (viz diskuse níže o chovných transgenních zakladatelích). Abychom je překonali, nyní nabízíme možnost vkládání jednokopírovacích transgenů do lokusů ROSA26 a H11. Kromě zajištění konzistentnější genové exprese mezi zvířaty vyžaduje tato metoda menší úsilí ze strany vyšetřovatele. Stejně důležité je, že k provádění experimentů pomocí této metody je zapotřebí méně zvířat. Další informace naleznete v popisu naší cílené služby transgeneze.

zpět na začátek

objednání

kontaktujte Jon Neumann pro formulář žádosti o službu. Vyplněný formulář musí být podepsán hlavním vyšetřovatelem. Podepsané formuláře mohou být doručeny Jon Neumann poštou, faxem, nebo jako naskenovaný obrázek.

kromě formuláře žádosti o službu jsou vyžadovány následující materiály:

  1. restrikční digest obsahující přibližně 50 mikrogramů vašeho plazmidu, řez tak, aby se uvolnil transgen z páteře plazmidu.
  2. fotografie alikvotu digestu analyzovaného elektroforézou agarózového gelu s jasně identifikovaným transgenním pásmem.
  3. stručný popis Konstrukce a fenotypu, který chcete vyrobit.
  4. doklad o schválení vašeho orgánu Výbor pro péči o zvířata a použití a Výbor pro biologickou bezpečnost pro váš protokol o použití zvířat a protokol rekombinantní DNA.
  5. pro klienty mimo areál je podepsána smlouva o převodu materiálu, včetně jména vašich transgénů, ve dvojím vyhotovení.

tipy a protokoly pro přípravu a testování vaší konstrukce DNA naleznete na našich stránkách pro přípravu a konstrukci DNA.

zpět na začátek

časy obratu

po obdržení konstrukce připravené k mikroinjekci spolu s nezbytnou dokumentací je minimální doba potřebná k výrobě transgenních zakladatelů, které lze přenést na klienta, přibližně 8 týdnů. To zahrnuje asi 2 týdny na objednání a přípravu dárců vajíček, 3 týdny těhotenství a 3 týdny od narození do odstavu.

Vezměte prosím na vědomí – Doba obratu může být delší, buď kvůli dříve naplánovaným objednávkám, nebo kvůli selhání výroby zakladatelů z první injekce. Zpoždění může být také způsobeno technickými obtížemi při identifikaci transgenních zakladatelů, což je obecně odpovědností klienta. Abychom minimalizovali dobu obratu, doporučujeme optimalizovat a otestovat protokol genotypizace v dostatečném předstihu před narozením mláďat. Pro PCR testy Otestujte specificitu a citlivost zředěním transgenu na genomovou DNA z myších ocasů (k dispozici z TMF) až na koncentraci ekvivalentní genu s jednou kopií. Pro transgen, který má délku 3 kb, by to odpovídalo 0.1 pikogram transgenu ve 100 nanogramech genomové DNA.

zpět na začátek

záruky výkonu

naše Standardní služba mikroinjekce DNA zaručuje produkci 3 transgenních zakladatelů nebo 50 celkem štěňat, podle toho, co nastane dříve. Pro tuto službu nejprve provedeme dva dny injekce DNA. Poté, co jsou tkáňové bopsie z výsledného potomstva testovány na přítomnost transgenu, jsou podle potřeby naplánovány další dny mikroinjekce.

naše jednodenní služba mikroinjekce DNA je, jak název napovídá, navržena tak, aby byla dokončena v jednom dni injekce. Tato služba je nabízena pro kmen B6SJLF2/J a kmen C57BL/6NJ, ačkoli nízké výnosy vajec a mláďat jsou často získávány z kmene C57BL/6NJ. I když nezaručujeme, že z této služby vyprodukujeme žádná štěňata nebo zakladatele, pokud jeden den injekce neprodukuje alespoň 1 transgenní zakladatel a výtěžek vajec pro tento den byl neobvykle nízký (více než jedna směrodatná odchylka pod průměrem za posledních 25 injekcí na stejném pozadí), zopakujeme to jednou bez dalších poplatků.

potenciální uživatelé obou služeb by si měli být vědomi toho, že přítomnost transgenu nezaručuje expresi transgenu.

zpět na začátek

popis služby

standardní i jednodenní služby zahrnují:

  • nákup dárců vajec.
  • Hyperovulace dárců vajíček a Páření se samci.
  • produkce pseudopregnantních pěstounských matek pářením outbredních ICR samic s vazektomizovanými samci a kontrolou vaginálních zátek ráno po injekci.
  • sklizeň vajec od utracených dárců.
  • ředění transgenové DNA klienta injekčním pufrem na koncentraci 2 ng / ul a injekce tohoto roztoku do jednoho pronukleusu každého oplodněného vajíčka.
  • přenos všech vajec, které přežijí injekční proces, do vajíček pseudopregnantních pěstounských matek.
  • sledování pěstounských matek před a po narození mláďat.
  • značení mláďat v každém vrhu distálním ořezáváním prstů, pohlavním stykem a (pokud je to nutné) řezáním ocasu ve věku přibližně deseti dnů.
  • přenos špiček nebo ocasních biopsií klientovi pro genotypizaci.
  • odstavení, identifikace a přenos nebo přeprava transgenních mláďat klientovi.

zpět na začátek

jaký kmen myši mám použít ?

nabízíme 2 kmeny dárců vajíček rutinně. Servisní poplatek se liší podle kmene kvůli rozdílům ve výnosech vajec a štěňat mezi těmito kmeny.

kmen s nejvyššími výnosy je hybridní kmen, b6sjlf2 / J. dárci vajec a samci jsou zakoupeni od Jackson Lab (Jax), kde jsou produkováni pářením samic C57BL/6J se samci SJL/J. Když jsou samci a samice b6sjlf1/J pářeni v našem zařízení k produkci oplodněných vajec pro mikroinjekci, vejce a výsledná štěňata jsou označována jako B6SJLF2. Myši B6SJLF1 / J jsou geneticky identické – každý pár chromozomů se skládá z jednoho chromozomu C57BL / 6J a jednoho chromozomu SJL/J. Naproti tomu jejich potomci B6SJLF2, přestože jsou stále přibližně 50% C57BL / 6J a 50% SJL / J, nejsou geneticky identičtí kvůli meiotické rekombinaci a budou mít různé barvy srsti.

kmen C57BL / 6NJ je dražší, protože produkuje nižší výnosy vajec a štěňat. Jeho rychlost transgeneze (procento mláďat, která jsou transgenní) je však přibližně stejná jako u ostatních kmenů, které běžně nabízíme (přibližně 15-20% všech mláďat je transgenních). Vezměte prosím na vědomí, že na rozdíl od substrainu C57BL/6J jsou c57bl/6NJ divokým typem genu Nnt (nikotinamid nukleotid transhydrogenáza). Další podrobnosti o substrain C57BL / 6J lze nalézt online.

zatímco jiné kmeny mohou být použity jako dárci vajíček, obvykle vyžadují další poplatky. Některé linie jsou velmi špatnými dárci a pokud je to možné, je třeba se jim vyhnout (např. Pokud nejsou k dispozici žádné údaje o vhodnosti daného kmene pro použití jako dárci vajíček nebo pokud je známo, že je problematický, můžeme nabídnout pouze jednodenní službu.

zpět na začátek

chov transgenních zakladatelů

při mikroinjekci do pronukleí jsou transgeny náhodně integrovány do genomu. Každý zakladatel tak bude mít jiné stránky integrace. Počet kopií transgenu, který má každý zakladatel, se může také lišit a v genomu může být více než jedno místo integrace. Také někteří zakladatelé mohou být mozaikou pro transgen. Z těchto důvodů by měl být každý zakladatel považován za samostatnou linii a chován nezávisle na jiných zakladatelích nesoucích stejný transgen (tj.

potomstvo musí být získáno od každého zakladatele, aby bylo možné otestovat přenos a expresi transgenu. Vzhledem k pozičním efektům a různým číslům kopií může mít každý řádek zakladatele jinou úroveň výrazu. Ve skutečnosti nemůžeme zaručit, že bude dosaženo jakéhokoli vyjádření transgenu. Použití izolátorových sekvencí v transgenním konstruktu může pomoci zabránit takovým okolnostem.

transgen nemusí být nutně přenášen Mendelovským způsobem daným zakladatelem. Zakladatelé mohou být mozaikou pro transgen, pokud dojde k integraci po prvním dělení buněk. Mozaicismus může mít za následek četnost dědičnosti menší než 50% u potomků první generace. U některých zakladatelů se transgen může integrovat do více než jednoho lokusu, což má za následek frekvenci dědičnosti více než 50%. V tomto případě se úrovně exprese u potomků první generace mohou lišit v závislosti na tom, které integrační místo zdědí.

méně častým problémem je ztráta transgenu, která může být způsobena meiotickou rekombinací. Občas, transgenová exprese může být v následujících generacích vypnuta kvůli methylaci, což může souviset se skutečností, že většina transgenů je vložena jako konkatemery od hlavy k ocasu obsahující více kopií transgenu. Nyní nabízíme další metody výroby transgenních myší pomocí homologní rekombinace na lokusech ROSA26 a H11, která eliminuje problémy spojené s náhodně vloženými transgeny. Podívejte se na naši cílenou službu transgeneze.

pokud je použita inbrední linie dárců vajíček (tj. C57BL / 6NJ), měli by být zakladatelé chováni na stejném pozadí, aby si udrželi inbrední status. Pro zakladatele z hybridního kmene B6SJLF2 / J se klient musí rozhodnout, zda se vrátí k inbrední linii nebo zachová smíšené pozadí.

myši, které mají transgen na jednom chromozomu, se nazývají „hemizygotní“, protože nemají odpovídající alelu na druhém chromozomu. V mnoha případech je možné produkovat homozygotní transgeny, které mohou mít vyšší úroveň exprese než odpovídající hemizygotní myši, ale rozlišení homozygotů od hemizygotů může být obtížné. Musí být použit kvantitativní genotypový test (např. kvantitativní PCR nebo Southern blotting). Alternativně lze podezření na homozygoty přejít na myši divokého typu a všechny potomky testovat, aby se zjistilo, zda jsou hemizygotní.

nakonec by si vyšetřovatelé měli být vědomi toho, že v přibližně 10% případů je integrace transgenu spojena se změnami struktury genomu (tj. delece, inzerce, inverze), které mohou vést k recesivní mutaci. Mechanismus, který je základem, není jasný, ale může zahrnovat fyzické poškození zhutněného chromatinu mikoinjekční jehlou během injekce DNA transgenu.

zpět na začátek

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.