SRMAtlas Home

udvalgte/Multiple reaktionsovervågningsassays, udført på tredobbelte kvadrupolinstrumenter, kan kobles til væskekromatografi til analyse af komplekse proteomfordøjelser.

i SRM/MRM-analyser anvendes de første (1.kvartal) og sidste (3. kvartal) masseanalysatorer af et tredobbelt kvadrupolmassespektrometer som massefiltre til at isolere en peptidion og en tilsvarende fragmention. Signalet fra fragmention overvåges derefter over den kromatografiske elueringstid (Fig. 1). Selektiviteten som følge af de to filtreringstrin kombineret med den høje arbejdscyklus resulterer i kvantitative analyser med uovertruffen følsomhed og specificitet. De specifikke par m/å-værdier, der er forbundet med de valgte precursor-og fragmentioner, kaldes “overgange” og udgør effektivt massespektrometriske assays, der gør det muligt at identificere og kvantificere et specifikt peptid og ved slutning det tilsvarende protein i en kompleks proteinfordøjelse.

Figur 1.

processen med etablering af et SRM/MRM-assay for et protein består af en række trin:
1. Udvælgelse af det passende peptid/s, unikt for proteinet af interesse og viser signalrespons med høj massespektrometri (proteotypiske peptider, PTP ‘ er) for at maksimere følsomheden af analysen
2. Udvælgelse af overvejende peptidfragmenter, der er specifikke for peptidet af interesse, der skal anvendes i MRM-overgangen
3. Til sidst, for hvert peptid-fragmentpar, optimering af specifikke MS-parametre (f.eks. kollisionsenergien) for at maksimere signalresponsen/følsomheden
4. Validering af MRM-analysen for at bekræfte peptididentitet, f.eks. ved at erhverve et fuldt MS2-spektrum af peptidet i det tredobbelte firpol-instrument, der anvendes til MRM
5. Ekstraktion af de endelige “koordinater” for MRM-analysen, inklusive de valgte peptid-og peptidfragmenter, de tilsvarende masse-til-ladningsforhold, fragmentintensitetsforholdene, den tilknyttede kollisionsenergi og den kromatografiske elueringstid, der eventuelt skal anvendes i tidsbegrænsede MRM-analyser

samlet set er dette en langvarig og iterativ proces, men når en MRM-analyse for et protein er etableret, bliver det universelt nyttigt, dvs. den kedelige analyseudviklingsproces skal kun udføres en gang for en given type massespektrometer og fragmenteringsmekanisme (f.eks.

i MRMAtlas præsenteres hvert proteinassay som et sæt optimale MRM-koordinater for peptidet(E), der repræsenterer et protein. Peptididentifikationer er blevet valideret ved at erhverve de tilsvarende tandemmassespektre på det tredobbelte kvadrupolmassespektrometer, som kan ses som enkelt-eller konsensusspektre. De endelige analysekoordinater kan hentes direkte i tabelformat, som kan indsættes direkte i en MRM/SRM-metode til et tredobbelt kvadrupol-instrument og bruges til specifikt at detektere og kvantificere proteinet af interesse i en kompleks proteinfordøjelse.

(tilpasset fra: A. Schimdt, P. Picotti og R. Aebersold proteomanalyse og systembiologi BIOspektrum, 1/2008, S. 44)

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.