DNA-Mikroinjektionsdienste

  • Hintergrund
  • Bestellung
  • Durchlaufzeiten
  • Leistungsgarantien
  • Leistungsbeschreibung
  • Überlegungen zu Mausstämmen
  • Züchtung transgener Gene

Hintergrund

Seit 1980 transgene Mäuse wurden routinemäßig durch Injektion einer DNA-Lösung in einen Vorkern eines befruchteten Eies erzeugt. In einem Teil der injizierten Eier wird die DNA in eines der Chromosomen integriert. Zellen, die von diesem befruchteten Ei abstammen, einschließlich Keimzellen, können die transgene DNA enthalten. Mäuse mit dem Transgen können gezüchtet und analysiert werden, um die Wirkung des Transgens auf die Mausentwicklung, Reproduktion oder Homöostase zu untersuchen.

Mäuse sind für dieses Verfahren besonders geeignet, da es einfach ist, eine große Anzahl befruchteter Eier von einer relativ kleinen Anzahl von Tieren zu sammeln. Um Eier zu produzieren, erhalten die Eizellspender zwei Hormoninjektionen im Abstand von 46-48 Stunden. Dieser Prozess (Superovulation genannt) bewirkt, dass sie mehr als die übliche Anzahl von Eiern freisetzen und für die Paarung empfänglich werden. Die superovulierten weiblichen Mäuse werden mit fruchtbaren männlichen Mäusen gepaart und die Eier werden am nächsten Morgen geerntet.

Die Mikroinjektion von DNA wird kurz nach der Befruchtung durchgeführt. Die Vorkerne von Mauseiern lassen sich leicht mit einer DIC-Optik (Differential Interference Contrast) visualisieren (siehe Bild rechts). Befruchtete Eier haben zwei Vorkerne, einen von jedem Gameten. Die injizierte DNA kann sich während der Chromosomenreplikation in Chromosomen im injizierten Vorkern integrieren. Nachdem sich die DNA in jedem Vorkern dupliziert hat, brechen die Vorkernhüllen zusammen, die duplizierten Chromosomen richten sich auf der Metaphasenplatte aus und die befruchtete Eizelle teilt sich, um einen Mausembryo im zweizelligen Stadium zu bilden.

Nach der Injektion mit DNA werden überlebende befruchtete Eizellen chirurgisch auf die Eileiter pseudopregnanter Mäuse übertragen. Pseudopregnante Mäuse werden durch Paarung fruchtbarer Weibchen mit vasektomierten Männchen produziert. Da die Männchen steril sind, produzieren die Weibchen keine eigenen befruchteten Embryonen. Der Prozess der Paarung stimuliert jedoch ihren Fortpflanzungstrakt, um die Entwicklung befruchteter Eier nach dem chirurgischen Transfer zu unterstützen. Wenn sich die injizierte DNA in ein Chromosom integriert hat, sollten die Nachkommen, die aus der Übertragung der injizierten Eier resultieren, das Transgen in einigen oder allen Zellen in ihrem Körper enthalten.

Nach der Geburt von Mauswelpen wird eine kleine Gewebebiopsie durchgeführt und DNA extrahiert und auf das Vorhandensein des Transgens analysiert. Im Durchschnitt haben etwa 15-20% der Mäuse, die wir aus der DNA-Mikroinjektion hergestellt haben, positiv auf das Transgen getestet. Die ersten Mäuse, die das Transgen tragen, werden als ‚Gründer‘ (oder F0) transgene Tiere bezeichnet. Die F0-Mäuse werden anschließend mit Wildtyp-Mäusen gepaart, um F1-Nachkommen zu identifizieren, die das Transgen enthalten, und neue Linien (Stämme) transgener Mäuse werden etabliert.

Obwohl beliebt, hat diese Methode zur Herstellung transgener Mäuse einige Nachteile (siehe die Diskussion unten über die Züchtung transgener Mäuse). Um diese zu überwinden, bieten wir jetzt die Möglichkeit, Einzelkopien-Transgene in die Loci ROSA26 und H11 einzufügen. Diese Methode bietet nicht nur eine konsistentere Genexpression zwischen Tieren, sondern erfordert auch weniger Aufwand seitens des Prüfers. Ebenso wichtig ist, dass weniger Tiere benötigt werden, um Experimente mit dieser Methode durchzuführen. Weitere Informationen finden Sie in der Beschreibung unseres Targeted Transgenesis Service.

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Bestellung

Kontaktieren Sie Jon Neumann für ein Serviceanfrageformular. Das ausgefüllte Formular muss vom Principal Investigator unterzeichnet werden. Unterschriebene Formulare können Jon Neumann per Post, Fax oder als gescanntes Bild zugestellt werden.

Zusätzlich zum Serviceanfrageformular werden folgende Materialien benötigt:

  1. Ein Restriktionsverdau, der ungefähr 50 Mikrogramm Ihres Plasmids enthält, wird so geschnitten, dass das Transgen aus dem Plasmidgerüst freigesetzt wird.
  2. Ein Foto eines Aliquots des Digests, das durch Agarosegelelektrophorese analysiert wurde, wobei die Transgenbande eindeutig identifiziert wurde.
  3. Eine kurze Beschreibung des Konstrukts und des Phänotyps, den Sie zu produzieren hoffen.
  4. Nachweis der Genehmigung des Animal Care and Use Committee und des Biosafety Committee Ihrer Einrichtung für Ihr Animal Use Protocol und das rekombinante DNA-Protokoll.
  5. Für Kunden außerhalb des Campus ein Materialtransfervertrag, einschließlich Name (n) Ihres Transgens (Ihrer Transgene), in zweifacher Ausfertigung unterzeichnet.

Tipps und Protokolle zur Vorbereitung und zum Testen Ihres DNA-Konstrukts finden Sie auf unseren DNA-Vorbereitungs- und Konstruktdesignseiten.

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Durchlaufzeiten

Nach Erhalt eines mikroinjektionsfertigen Konstrukts zusammen mit den erforderlichen Unterlagen beträgt die Mindestzeit für die Herstellung transgener Zellen, die auf den Kunden übertragen werden können, etwa 8 Wochen. Dies beinhaltet etwa 2 Wochen, um die Eizellspender zu bestellen und vorzubereiten, 3 Wochen Schwangerschaftszeit und 3 Wochen von der Geburt bis zur Entwöhnung.

Bitte beachten Sie – die Bearbeitungszeit kann länger sein, entweder aufgrund zuvor geplanter Bestellungen oder aufgrund eines Fehlers bei der Herstellung von Produkten ab der ersten Injektion. Verzögerungen können auch durch technische Schwierigkeiten bei der Identifizierung transgener Organismen verursacht werden, was im Allgemeinen in der Verantwortung des Kunden liegt. Um die Durchlaufzeiten zu minimieren, empfehlen wir, Ihr Genotypisierungsprotokoll lange vor der Geburt der Welpen zu optimieren und zu testen. Testen Sie für PCR-Assays die Spezifität und Sensitivität, indem Sie Ihr Transgen in genomische DNA aus Mausschwänzen (erhältlich von der TMF) verdünnen, bis zu einer Konzentration, die einem Einzelkopie-Gen entspricht. Für ein Transgen, das 3 kb lang ist, wäre dies äquivalent zu 0.1 Picogramm Transgen in 100 Nanogramm genomischer DNA.

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Leistungsgarantien

Unser Standard-DNA-Mikroinjektionsservice garantiert die Produktion von 3 transgenen Gründern oder insgesamt 50 Welpen, je nachdem, was zuerst eintritt. Für diesen Service führen wir zunächst zwei Tage DNA-Injektion durch. Nachdem Gewebebopsien der resultierenden Nachkommen auf das Vorhandensein des Transgens untersucht wurden, werden nach Bedarf zusätzliche Tage der Mikroinjektion geplant.

Unser eintägiger DNA-Mikroinjektionsservice ist, wie der Name schon sagt, so konzipiert, dass er an einem Tag der Injektion abgeschlossen ist. Dieser Service wird für den Stamm B6SJLF2 / J und den Stamm C57BL / 6NJ angeboten, obwohl mit dem Stamm C57BL / 6NJ häufig niedrige Erträge an Eiern und Welpen erzielt werden. Wir garantieren zwar nicht, dass aus diesem Service Welpen oder Gründer hervorgehen, aber wenn ein Tag der Injektion nicht mindestens 1 transgenen Gründer hervorbringt und die Eizellausbeute für diesen Tag ungewöhnlich niedrig war (mehr als eine Standardabweichung unter dem Mittelwert für die letzten 25 Injektionen auf demselben Hintergrund), werden wir es einmal ohne zusätzliche Kosten wiederholen.

Potenzielle Nutzer beider Dienste sollten sich bewusst sein, dass das Vorhandensein eines Transgens keine Expression des Transgens garantiert.

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Leistungsbeschreibung

Sowohl der Standard- als auch der eintägige Service umfassen:

  • Kauf von Eizellspendern.
  • Hyperovulation von Eizellspendern und Paarung mit Deckrüden.
  • Produktion von pseudopregnanten Pflegemüttern durch Paarung von Outbred ICR-Weibchen mit vasektomierten Männchen und Überprüfung auf Vaginalpfropfen am Morgen der Injektion.
  • Ernte von Eiern von eingeschläferten Spendern.
  • Verdünnung der Transgen-DNA des Klienten mit Injektionspuffer auf eine Konzentration von 2 ng / ul und Injektion dieser Lösung in einen Vorkern jeder befruchteten Eizelle.
  • Übertragung aller Eier, die den Injektionsprozess überleben, in die Eileiter pseudopregnanter Pflegemütter.
  • Überwachung von Pflegemüttern vor und nach der Geburt von Welpen.
  • Markieren von Welpen in jedem Wurf durch distales Zehenschneiden, Geschlechtsbestimmung und (falls erforderlich) Schwanzschneiden im Alter von etwa zehn Tagen.
  • Übertragung von Zehen- oder Schwanzbiopsien an den Kunden zur Genotypisierung.
  • Entwöhnung, Identifizierung und Transfer oder Versand transgener Welpen an den Kunden.

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Welchen Mausstamm sollte ich verwenden?

Wir bieten routinemäßig 2 Stämme von Eizellspendern an. Die Servicegebühr variiert je nach Sorte aufgrund der Unterschiede in der Ei- und Welpenausbeute zwischen diesen Stämmen.

Der Stamm mit den höchsten Erträgen ist der Hybridstamm B6SJLF2 / J. Eizellspender und Deckrüden werden im Jackson Lab (Jax) gekauft, wo sie durch Paarung von C57BL / 6J-Weibchen mit SJL / J-Männchen produziert werden. Wenn B6SJLF1 / J-Männchen und -Weibchen in unserer Anlage gepaart werden, um befruchtete Eier für die Mikroinjektion zu produzieren, werden die Eier und die resultierenden Welpen als B6SJLF2 bezeichnet. B6SJLF1 / J-Mäuse sind genetisch identisch – jedes Chromosomenpaar besteht aus einem C57BL / 6J-Chromosom und einem SJL / J-Chromosom. Im Gegensatz dazu sind ihre B6SJLF2-Nachkommen, obwohl sie immer noch ungefähr 50% C57BL / 6J und 50% SJL / J sind, aufgrund der meiotischen Rekombination nicht genetisch identisch und haben eine Vielzahl von Fellfarben.

Der C57BL / 6NJ-Stamm ist teurer, weil er eine geringere Ausbeute an Eiern und Welpen produziert. Die Rate der Transgenese (Prozentsatz der Welpen, die transgen sind) ist jedoch ungefähr die gleiche wie bei den anderen Stämmen, die wir routinemäßig anbieten (etwa 15-20% aller Welpen sind transgen). Bitte beachten Sie, dass im Gegensatz zum C57BL / 6J-Substrat C57BL / 6NJ Wildtypen für das Nnt-Gen (Nicotinamid-Nukleotid-Transhydrogenase) sind. Weitere Details zum C57BL / 6J-Substrat finden Sie online.

Während andere Stämme als Eizellspender verwendet werden können, erfordern diese normalerweise zusätzliche Gebühren. Einige Linien sind sehr schlechte Spender und sollten nach Möglichkeit vermieden werden (z. B. BALB / c und DBA / 2J). Wenn keine Daten über die Eignung eines bestimmten Stammes für die Verwendung als Eizellspender vorliegen oder wenn bekannt ist, dass er problematisch ist, können wir nur den eintägigen Service anbieten.

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Züchtung transgener Gene

Bei der Mikroinjektion in Vorkerne werden Transgene zufällig in das Genom integriert. So wird jeder Gründer eine andere Website (s) der Integration haben. Die Anzahl der Kopien des Transgens, die jeder Gründer besitzt, kann ebenfalls unterschiedlich sein, und es kann mehr als eine Integrationsstelle innerhalb des Genoms geben. Außerdem können einige Gründer für das Transgen verantwortlich sein. Aus diesen Gründen sollte jeder Gründer als separate Linie behandelt und unabhängig von anderen Gründern gezüchtet werden, die dasselbe Transgen tragen (dh keine Gründer miteinander paaren).

Nachkommen müssen von jedem Gründer erhalten werden, um die Übertragung und Expression des Transgens zu testen. Aufgrund von Positionseffekten und unterschiedlichen Kopienummern kann jede Kopierzeile eine andere Ausdrucksebene haben. In der Tat können wir nicht garantieren, dass eine Expression des Transgens erhalten wird. Die Verwendung von Isolatorsequenzen in einem Transgenkonstrukt kann dazu beitragen, solche Ocurrences zu verhindern.

Das Transgen wird nicht notwendigerweise in mendelscher Weise von einem gegebenen Gründer übertragen. Es kann Mosaik für das Transgen sein, wenn die Integration nach der ersten Zellteilung erfolgt. Mosaizismus kann bei Nachkommen der ersten Generation zu einer Vererbungshäufigkeit von weniger als 50% führen. In einigen Fällen kann sich das Transgen in mehr als einen Locus integrieren, was zu einer Vererbungshäufigkeit von mehr als 50% führt. In diesem Fall können die Expressionsniveaus unter den Nachkommen der ersten Generation variieren, abhängig davon, welche Integrationsstelle sie erben.

Ein weniger häufiges Problem ist der Verlust des Transgens insgesamt, der durch meiotische Rekombination verursacht werden kann. Gelegentlich kann die Transgenexpression in nachfolgenden Generationen aufgrund der Methylierung abgeschaltet werden, was mit der Tatsache verbunden sein kann, dass die meisten Transgene als Kopf-zu-Schwanz-Konkatemere eingefügt werden, die mehrere Kopien des Transgens enthalten. Wir bieten jetzt andere Methoden zur Herstellung transgener Mäuse unter Verwendung homologer Rekombination an den Loci ROSA26 und H11 an, die die mit zufällig inserierten Transgenen verbundenen Probleme beseitigen. Sehen Sie sich unseren Targeted Transgenesis Service an.

Wenn eine Inzuchtlinie von Eizellenspendern verwendet wird (d. h. C57BL / 6NJ), sollten die Gründer auf denselben Hintergrund gezüchtet werden, um den Inzuchtstatus zu erhalten. Für Gründer aus dem hybriden Stamm B6SJLF2 / J muss der Kunde entscheiden, ob er zu einer Inzuchtlinie zurückkreuzt oder einen gemischten Hintergrund beibehält.

Mäuse, die das Transgen auf einem Chromosom haben, werden als „hemizygot“ bezeichnet, weil sie kein entsprechendes Allel auf dem anderen Chromosom haben. In vielen Fällen ist es möglich, homozygote Transgene zu produzieren, und diese können ein höheres Expressionsniveau aufweisen als die entsprechenden hemizygoten Mäuse, aber die Unterscheidung von Homozygoten von Hemizygoten kann schwierig sein. Es muss ein quantitativer Genotypisierungstest verwendet werden (z. B. quantitative PCR oder Southern Blotting). Alternativ können vermutete Homozygoten mit Wildtyp-Mäusen gekreuzt und alle Nachkommen getestet werden, um zu sehen, ob sie hemizygot sind.

Schließlich sollten sich die Forscher darüber im Klaren sein, dass die Integration des Transgens in etwa 10% der Fälle mit Veränderungen der Genomstruktur verbunden ist (d. H. Deletionen, Insertionen, Inversionen), die zu einer rezessiven Mutation führen können. Der Mechanismus, der diesem zugrunde liegt, ist nicht klar, kann jedoch eine physikalische Schädigung des verdichteten Chromatins durch die Mikroinjektionsnadel während der Injektion des DNA-Transgens beinhalten.

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