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Selected/Multiple reaction Monitoring Assays, durchgeführt mit Triple-Quadrupol-Instrumenten, können zur Analyse komplexer Proteomverdauungen mit der Flüssigkeitschromatographie gekoppelt werden.

In SRM/MRM-Assays werden die ersten (Q1) und letzten (Q3) Massenanalysatoren eines Triple-Quadrupol-Massenspektrometers als Massenfilter zur Isolierung eines Peptidions und eines entsprechenden Fragmentions verwendet. Das Signal des Fragmentions wird dann über die chromatographische Elutionszeit überwacht (Fig. 1). Die aus den beiden Filterstufen resultierende Selektivität in Kombination mit dem hohen Tastverhältnis führt zu quantitativen Analysen mit unübertroffener Sensitivität und Spezifität. Die spezifischen Paare von m / z-Werten, die den ausgewählten Vorläufer- und Fragmentionen zugeordnet sind, werden als „Übergänge“ bezeichnet und stellen effektiv massenspektrometrische Assays dar, die es ermöglichen, ein spezifisches Peptid und durch Inferenz das entsprechende Protein in einem komplexen Proteinverdau zu identifizieren und zu quantifizieren.

Abbildung 1.

Der Prozess der Etablierung eines SRM/MRM-Assays für ein Protein besteht aus mehreren Schritten:
1. Auswahl der geeigneten Peptide, die für das Protein von Interesse einzigartig sind und eine hohe massenspektrometrische Signalantwort zeigen (proteotypische Peptide, PTPs), um die Empfindlichkeit des Assays zu maximieren
2. Auswahl vorherrschender Peptidfragmente, die für das interessierende Peptid spezifisch sind, um im MRM-Übergang verwendet zu werden
3. Schließlich, für jedes Peptid-Fragment-Paar, Optimierung spezifischer MS-Parameter (z. B. die Kollisionsenergie) zur Maximierung der Signalantwort / Empfindlichkeit
4. Validierung des MRM-Assays zur Bestätigung der Peptididentität, z. B. durch Erfassung eines vollständigen MS2-Spektrums des Peptids im Triple-Quadrupol-Instrument, das für MRM
5 verwendet wird. Extraktion der endgültigen „Koordinaten“ des MRM-Assays, einschließlich des ausgewählten Peptids und der Peptidfragmente, der entsprechenden Masse-zu-Ladung-Verhältnisse, der Fragmentintensitätsverhältnisse, der zugehörigen Kollisionsenergie und der chromatographischen Elutionszeit, die optional in zeitlich begrenzten MRM-Analysen verwendet werden kann

Insgesamt ist dies ein langwieriger und iterativer Prozess, der jedoch, sobald ein MRM-Assay für ein Protein etabliert ist, universell nützlich wird, d.h. der langwierige Assay-Entwicklungsprozess muss für einen bestimmten Massenspektrometertyp und Fragmentierungsmechanismus (z. B. kollisionsinduzierte Dissoziation) nur einmal durchgeführt werden.

Im MRMAtlas wird jeder Proteinassay als Satz optimaler MRM-Koordinaten für das/die Peptid(e) dargestellt, die ein Protein repräsentieren. Peptid-Identifizierungen wurden validiert, indem die entsprechenden Tandem-Massenspektren auf dem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer erfasst wurden, die als Einzel- oder Konsensusspektren betrachtet werden können. Die endgültigen Assaykoordinaten können direkt im Excel-Tabellenformat heruntergeladen werden, das direkt in eine MRM / SRM-Methode eines Triple-Quadrupol-Instruments eingefügt und zum spezifischen Nachweis und zur Quantifizierung des interessierenden Proteins in einem komplexen Proteinverdau verwendet werden kann.

(Adaptiert aus: A. Schimdt, P. Picotti und R. Aebersold Proteomanalyse und systembiologie BIOspektrum, 1/2008, S. 44)

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