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Los ensayos de monitoreo de reacción múltiple seleccionados, realizados en instrumentos de triple cuadrupolo, se pueden acoplar a cromatografía líquida para el análisis de digestiones de proteomas complejos.

En los ensayos SRM / MRM, el primer (Q1) y el último (Q3) analizadores de masa de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo se utilizan como filtros de masa para aislar un ion péptido y un ion fragmento correspondiente. La señal del fragmento de ion se monitoriza a lo largo del tiempo de elución cromatográfica (Fig. 1). La selectividad resultante de las dos etapas de filtrado, combinada con el alto ciclo de trabajo, da como resultado análisis cuantitativos con sensibilidad y especificidad inigualables. Los pares específicos de valores m/z asociados a los iones precursores y fragmentos seleccionados se denominan «transiciones» y constituyen efectivamente ensayos espectrométricos de masas que permiten identificar y cuantificar un péptido específico y, por inferencia, la proteína correspondiente en un complejo digerido de proteínas.

Figura 1.

El proceso de establecer un ensayo SRM / MRM para una proteína consta de una serie de pasos:
1. Selección del péptido / s apropiado / s, exclusivo de la proteína de interés y que muestre una respuesta de señal de espectrometría de alta masa (péptidos proteotípicos, PTP), para maximizar la sensibilidad del ensayo
2. Selección de fragmentos de péptidos predominantes específicos del péptido de interés para ser utilizados en la transición de MRM
3. Eventualmente, para cada par péptido-fragmento, optimización de parámetros específicos de MS (por ejemplo, la energía de colisión) para maximizar la respuesta/sensibilidad de la señal
4. Validación del ensayo de MRM para confirmar la identidad del péptido, por ejemplo, adquiriendo un espectro MS2 completo del péptido en el instrumento de triple cuadrupolo utilizado para MRM
5. Extracción de las «coordenadas» finales del ensayo de MRM, incluidos el péptido y los fragmentos de péptidos seleccionados, las relaciones de masa a carga correspondientes, las relaciones de intensidad de fragmentos, la energía de colisión asociada y el tiempo de elución cromatográfica que se utilizará opcionalmente en análisis de MRM con limitaciones de tiempo

En general, este es un proceso largo e iterativo, pero, una vez que se establece un ensayo de MRM para una proteína, se vuelve universalmente útil, p. ej. el tedioso proceso de desarrollo de ensayos solo debe realizarse una vez, para un tipo determinado de espectrómetro de masas y mecanismo de fragmentación (por ejemplo, disociación inducida por colisión).

En el MRMAtlas, cada ensayo de proteína se presenta como un conjunto de coordenadas MRM óptimas para los péptidos que representan una proteína. Las identificaciones de péptidos se han validado mediante la adquisición de los espectros de masa en tándem correspondientes en el espectrómetro de masas de triple cuadrupolo, que se pueden ver como espectros individuales o de consenso. Las coordenadas finales del ensayo se pueden descargar directamente en formato de tabla de Excel, que se pueden pegar directamente en un método MRM/SRM de un instrumento de triple cuadrupolo y se pueden usar para detectar y cuantificar específicamente la proteína de interés en un digerido de proteínas complejo.

(Adaptado de: A. Schimdt, P. Picotti y R. Aebersold Proteomeanalyse und systembiologie BIOspektrum, 1/2008, S. 44)

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