SRMAtlas Home

Selected / Multiple reaction monitoring assays, conditioned on triple quadrupole instruments, can be connected to nestekromatography for the analysis of complex proteome digests.

SRM / MRM-määrityksissä käytetään kolmoiskvadrupolimassaspektrometrin ensimmäistä (Q1) ja viimeistä (Q3) massa-analysaattoria peptidi-ionin ja vastaavan fragmentti-ionin eristämiseksi massasuodattimina. Tämän jälkeen fragmentti-ionin signaalia seurataan kromatografisella eluutioajalla (Kuva. 1). Kahdesta suodatusvaiheesta johtuva valikoivuus yhdistettynä suureen käyttöjaksoon johtaa kvantitatiivisiin analyyseihin, joiden herkkyys ja spesifisyys ovat vertaansa vailla. Valittuihin prekursori-ja fragmentti-ioneihin liittyviä spesifisiä m / z-arvojen pareja kutsutaan ”siirtymiksi”, ja ne muodostavat tehokkaasti massaspektrometrisiä määrityksiä, joiden avulla voidaan tunnistaa ja kvantifioida tietty peptidi ja päättelemällä vastaava proteiini monimutkaisessa proteiinin sulatuksessa.

Kuva 1.

prosessi, jossa määritetään SRM/MRM-määritys jollekin proteiinille, koostuu useista vaiheista:
1. Valitaan sopiva peptidi/s, joka on ainutlaatuinen kyseiselle proteiinille ja jolla on suuri massaspektrometrinen signaalivaste (proteotyyppiset peptidit, PTPs), jotta voidaan maksimoida määrityksen herkkyys
2. MRM-siirtymävaiheessa
3 käytettävien pääasiallisten peptidifragmenttien valinta. Lopulta kullekin peptidi-fragmenttiparille optimoidaan tietyt MS-parametrit (esim.törmäysenergia) signaalin vasteen/herkkyyden maksimoimiseksi
4. MRM-määrityksen validointi peptidin identiteetin vahvistamiseksi, esim.hankkimalla täydellinen MS2-spektri peptidistä kolmoiskvadrupolivälineessä, jota käytetään MRM
5. MRM-määrityksen lopullisten ”koordinaattien” uuttaminen, mukaan lukien valitut peptidi-ja peptidifragmentit, vastaavat massa-varaussuhteet, fragmenttien intensiteettisuhteet, niihin liittyvä törmäysenergia ja kromatografinen eluutioaika, jota voidaan käyttää valinnaisesti aikarajoitteisissa MRM-analyyseissä

, on pitkä ja iteratiivinen prosessi, mutta kun MRM-määritys proteiinille on vahvistettu, siitä tulee yleisesti hyödyllinen, ts. pitkäveteinen määrityskehitysprosessi on suoritettava vain kerran tietyntyyppiselle massaspektrometrille ja sirpaloitumismekanismille (esim.törmäyksen aiheuttama dissosiaatio).

mrmatlas-testissä jokainen proteiinimääritys esitetään optimaalisina MRM-koordinaatteina proteiinia edustaville peptideille. Peptiditunnistukset on validoitu hankkimalla vastaava tandem-massaspektri kolmoiskvadrupolimassaspektrometrillä, jota voidaan pitää yksi-tai konsensuspektrinä. Lopulliset määrityskoordinaatit voidaan ladata suoraan Excel-taulukkomuodossa, joka voidaan liittää suoraan kolmoiskvadrupolivälineen MRM/SRM-menetelmään ja jota käytetään erityisesti monimutkaisen proteiinidiilen kiinnostavan proteiinin havaitsemiseen ja kvantifiointiin.

(Adapted from: A. Schimdt, P. Picotti and R. Aebersold Proteomeanalyse und systembiologie BIOspektrum, 1/2008, S. 44)

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.