Services de Microinjection d’ADN

  • Contexte
  • Commande
  • Délais d’exécution
  • Garanties de performance
  • Description du service
  • Considérations sur la souche de souris
  • Fondateurs transgéniques reproducteurs

Contexte

Depuis 1980 des souris transgéniques ont été générées de manière routinière en injectant une solution d’ADN dans un pronucleus d’un ovule fécondé. Dans une proportion d’ovules injectés, l’ADN s’intègre dans l’un des chromosomes. Les cellules descendant de cet ovule fécondé, y compris les cellules germinales, peuvent contenir l’ADN transgénique. Des souris avec le transgène peuvent être élevées et analysées pour étudier l’effet du transgène sur le développement, la reproduction ou l’homéostasie de la souris.

Les souris sont particulièrement adaptées à cette procédure car il est facile de collecter un grand nombre d’œufs fécondés sur un nombre relativement faible d’animaux. Pour produire des œufs, les donneuses d’ovules reçoivent deux injections d’hormones espacées de 46 à 48 heures. Ce processus (appelé superovulation) les fait libérer plus que le nombre habituel d’œufs et devenir réceptifs à l’accouplement. Les souris femelles superovulées sont accouplées avec des souris mâles fertiles et les œufs sont récoltés le lendemain matin.

La microinjection de l’ADN est réalisée peu de temps après la fécondation. Les pronucléi des œufs de souris sont facilement visualisés à l’aide d’optiques de Contraste d’interférence différentielle (DIC) (voir l’image à droite). Les œufs fécondés ont deux pronucléi, un de chaque gamète. L’ADN injecté peut s’intégrer dans les chromosomes du pronucléus injecté lors de la réplication chromosomique. Une fois l’ADN de chaque pronucléus dupliqué, les enveloppes pronucléaires se décomposent, les chromosomes dupliqués s’alignent sur la plaque de métaphase et l’ovocyte fécondé se divise pour former un embryon de souris à deux cellules.

Après injection d’ADN, les ovules fécondés survivants sont transférés chirurgicalement aux oviductes de souris pseudopregnantes. Les souris pseudopregnantes sont produites en accouplant des femelles fertiles avec des mâles vasectomisés. Comme les mâles sont stériles, les femelles ne produisent pas d’embryons fécondés. Cependant, le processus d’accouplement stimule leur appareil reproducteur pour soutenir le développement des œufs fécondés après un transfert chirurgical. Si l’ADN injecté s’est intégré dans un chromosome, la progéniture résultant du transfert des ovules injectés devrait contenir le transgène dans une partie ou la totalité des cellules de leur corps.

Après la naissance des petits de souris, une petite biopsie tissulaire est réalisée et l’ADN est extrait et analysé pour détecter la présence du transgène. En moyenne, environ 15 à 20% des souris que nous avons produites à partir de la microinjection d’ADN ont été testées positives pour le transgène. Les souris initiales porteuses du transgène sont appelées animaux transgéniques « fondateurs » (ou F0). Les souris F0 sont ensuite accouplées avec des souris de type sauvage pour identifier la progéniture F1 contenant le transgène et de nouvelles lignées (souches) de souris transgéniques sont établies.

Bien que populaire, cette méthode de production de souris transgéniques présente quelques inconvénients (voir la discussion ci-dessous sur la sélection de fondateurs transgéniques). Pour y remédier, nous offrons désormais la possibilité d’insérer des transgènes à copie unique dans les loci ROSA26 et H11. En plus de fournir une expression génique plus cohérente entre les animaux, cette méthode nécessite moins d’efforts de la part du chercheur. D’une importance égale, moins d’animaux sont nécessaires pour effectuer des expériences en utilisant cette méthode. Pour plus d’informations, consultez la description de notre service de transgénèse ciblée.

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Commande

Contactez Jon Neumann pour un Formulaire de demande de service. Le formulaire dûment rempli doit être signé par le chercheur principal. Les formulaires signés peuvent être remis à Jon Neumann par courrier, fax ou sous forme d’image numérisée.

En plus du Formulaire de demande de service, les documents suivants sont requis:

  1. Un digest de restriction contenant environ 50 microgrammes de votre plasmide, coupé de manière à libérer le transgène du squelette plasmidique.
  2. Une photo d’une aliquote du digest analysée par électrophorèse sur gel d’agarose, avec la bande transgénique clairement identifiée.
  3. Une brève description de la construction et du phénotype que vous espérez produire.
  4. Preuve de l’approbation du Comité de soins et d’utilisation des animaux de votre établissement et du Comité de biosécurité pour votre protocole d’utilisation des animaux et votre protocole d’ADN recombinant.
  5. Pour les clients hors campus, un Accord de transfert de matériel, y compris le(s) nom(s) de votre (vos) transgene(s), signé en double exemplaire.

Vous trouverez des conseils et des protocoles pour préparer et tester votre construction d’ADN sur nos pages Préparation et Conception de construction d’ADN.

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Délais d’exécution

Après réception d’une construction prête à la microinjection ainsi que des documents nécessaires, le temps minimum requis pour produire des fondateurs transgéniques pouvant être transférés au client est d’environ 8 semaines. Cela comprend environ 2 semaines pour commander et préparer les donneuses d’ovules, 3 semaines de gestation et 3 semaines de la naissance au sevrage.

Veuillez noter que le délai d’exécution peut être plus long, soit en raison de commandes programmées précédemment, soit en raison d’un défaut de production de fondeurs dès la première injection. Des retards peuvent également être causés par des difficultés techniques dans l’identification des fondateurs transgéniques, qui relèvent généralement de la responsabilité du client. Afin de minimiser les délais d’exécution, nous vous recommandons d’optimiser et de tester votre protocole de génotypage bien avant la naissance des petits. Pour les tests PCR, testez la spécificité et la sensibilité en diluant votre transgène en ADN génomique à partir de queues de souris (disponibles auprès du TMF), jusqu’à une concentration équivalente à un gène en une seule copie. Pour un transgène de 3 ko de longueur, cela équivaudrait à 0.1 picogramme de transgène dans 100 nanogrammes d’ADN génomique.

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Garanties de performance

Notre Service standard de Microinjection d’ADN garantit la production de 3 fondateurs transgéniques ou de 50 chiots au total, selon la première éventualité. Pour ce service, nous effectuons d’abord deux jours d’injection d’ADN. Une fois que les bopsies tissulaires de la progéniture résultante ont été testées pour détecter la présence du transgène, des jours supplémentaires de microinjection sont programmés au besoin.

Notre service de Microinjection d’ADN d’une journée est, comme son nom l’indique, conçu pour être terminé en une journée d’injection. Ce service est offert pour la souche B6SJLF2/J et la souche C57BL/6NJ, bien que de faibles rendements d’œufs et de petits soient souvent obtenus à partir de la souche C57BL/6NJ. Bien que nous ne garantissions pas de produire des chiots ou des fondateurs de ce service, si un jour d’injection ne produit pas au moins 1 fondateur transgénique et que le rendement en œufs pour ce jour-là était inhabituellement bas (plus d’un écart type en dessous de la moyenne pour les 25 dernières injections sur le même fond), nous le répéterons une fois sans frais supplémentaires.

Les utilisateurs potentiels de l’un ou l’autre service doivent être conscients que la présence d’un transgène ne garantit pas l’expression du transgène.

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Description du service

Les services standard et d’une journée comprennent:

  • Achat de donneuses d’ovules.
  • Hyperovulation de donneuses d’ovules et accouplement avec des mâles étalons.
  • Production de mères nourricières pseudopregnantes en accouplant des femelles ICR surprisées avec des mâles vasectomisés et en vérifiant la présence de bouchons vaginaux le matin de l’injection.
  • Récolte d’œufs de donneuses euthanasiées.
  • Dilution de l’ADN transgénique du client avec un tampon d’injection à une concentration de 2 ng / ul et injection de cette solution dans un pronucléus de chaque ovule fécondé.
  • Transfert de tous les œufs qui survivent au processus d’injection dans les oviductes de mères nourricières pseudopregnantes.
  • Surveillance des mères nourricières avant et après la naissance des petits.
  • Marquer les petits dans chaque portée par coupe distale des orteils, sexage et (si nécessaire) coupe de la queue à l’âge d’une dizaine de jours.
  • Transfert des biopsies des orteils ou de la queue au client pour le génotypage.
  • Sevrage, identification et transfert ou expédition de chiots transgéniques au client.

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Quelle Souche De Souris Dois-Je Utiliser?

Nous proposons 2 souches de donneuses d’ovules de manière routinière. Les frais de service varient selon la souche en raison des différences de rendements en œufs et en petits entre ces souches.

La souche avec les rendements les plus élevés est la souche hybride, B6SJLF2/J. Les donneurs d’ovules et les mâles étalons sont achetés au Jackson Lab (Jax), où ils sont produits en accouplant des femelles C57BL/6J avec des mâles SJL/J. Lorsque les mâles et les femelles B6SJLF1 / J sont accouplés dans notre établissement pour produire des œufs fécondés en vue d’une micro-injection, les œufs et les petits qui en résultent sont appelés B6SJLF2. Les souris B6SJLF1/J sont génétiquement identiques – chaque paire de chromosomes est constituée d’un chromosome C57BL/6J et d’un chromosome SJL/J. En revanche, leur progéniture B6SJLF2, tout en étant d’environ 50% C57BL / 6J et 50% SJL / J, n’est pas génétiquement identique en raison de la recombinaison méiotique et aura une variété de couleurs de pelage.

La souche C57BL/6NJ est plus chère car elle produit des rendements d’œufs et de petits plus faibles. Cependant, son taux de transgénèse (pourcentage de chiots transgéniques) est à peu près le même que les autres souches que nous proposons régulièrement (environ 15 à 20% de tous les chiots sont transgéniques). Veuillez noter que contrairement au sous-groupe C57BL/ 6J, les C57BL/ 6NJ sont de type sauvage pour le gène Nnt (transhydrogénase nucléotidique nicotinamide). Plus de détails sur la sous-chaîne C57BL / 6J peuvent être trouvés en ligne.

Alors que d’autres souches peuvent être utilisées comme donneuses d’ovules, celles-ci nécessitent généralement des frais supplémentaires. Certaines lignées sont de très mauvais donneurs et doivent être évitées si possible (par exemple, BALB/c et DBA/2J). Si aucune donnée n’est disponible sur l’aptitude d’une souche donnée à être utilisée comme donneuse d’ovules, ou si elle est connue pour être problématique, nous ne pouvons offrir le service qu’une journée.

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Sélection de fondateurs transgéniques

Lorsqu’ils sont microinjectés dans des pronucléi, les transgènes sont intégrés au hasard dans le génome. Ainsi, chaque fondateur aura un(des) site(s) d’intégration différent(s). Le nombre de copies du transgène possédées par chaque fondateur peut également être différent et il peut y avoir plus d’un site d’intégration dans le génome. En outre, certains fondateurs peuvent être une mosaïque pour le transgène. Pour ces raisons, chaque fondateur doit être traité comme une lignée distincte et élevé indépendamment des autres fondateurs portant le même transgène (c’est-à-dire qu’il ne faut pas accoupler les fondateurs entre eux).

La progéniture doit être obtenue de chaque fondateur pour tester la transmission et l’expression du transgène. En raison des effets de position et des numéros de copie différents, chaque ligne fondatrice peut avoir un niveau d’expression différent. En effet, nous ne pouvons garantir qu’une quelconque expression du transgène sera obtenue. L’utilisation de séquences isolantes dans une construction transgénique peut aider à prévenir de telles occurrences.

Le transgène ne sera pas nécessairement transmis de manière mendélienne par un fondateur donné. Les fondateurs peuvent être une mosaïque pour le transgène, si l’intégration se produit après la première division cellulaire. Le mosaïcisme peut entraîner une fréquence d’hérédité inférieure à 50% chez la progéniture de première génération. Chez certains fondateurs, le transgène peut s’intégrer dans plusieurs locus, ce qui entraîne une fréquence d’héritage de plus de 50%. Dans ce cas, les niveaux d’expression parmi la progéniture de première génération peuvent varier en fonction du site d’intégration dont ils héritent.

Un problème moins courant est la perte totale du transgène, qui peut être causée par la recombinaison méiotique. Parfois, l’expression du transgène peut être coupée dans les générations suivantes en raison de la méthylation, qui peut être liée au fait que la plupart des transgènes sont insérés sous forme de concatémères tête-queue contenant plusieurs copies du transgène. Nous proposons maintenant d’autres méthodes de fabrication de souris transgéniques, en utilisant la recombinaison homologue aux loci ROSA26 et H11, qui élimine les problèmes associés aux transgènes insérés au hasard. Consultez notre service de transgénèse ciblée.

Si une lignée consanguine de donneuses d’ovules est utilisée (c.-à-d. C57BL/ 6NJ), les fondateurs doivent être élevés dans le même contexte pour maintenir le statut consanguineux. Pour les fondateurs de la souche hybride B6SJLF2 / J, le client doit décider de rétrocroiser vers une lignée consanguine ou de conserver un arrière-plan mixte.

Les souris qui ont le transgène sur un chromosome sont appelées « hémizygotes » car elles n’ont pas d’allèle correspondant sur l’autre chromosome. Dans de nombreux cas, il est possible de produire des transgéniques homozygotes, et ceux-ci peuvent avoir un niveau d’expression plus élevé que les souris hémizygotes correspondantes, mais distinguer les homozygotes des hémizygotes peut être difficile. Un test de génotypage quantitatif doit être utilisé (p. ex., PCR quantitative ou Southern blot). Alternativement, les homozygotes suspectés peuvent être croisés à des souris de type sauvage et toutes les progénitures testées pour voir si elles sont hémizygotes.

Enfin, les chercheurs doivent savoir que dans environ 10% des cas, l’intégration du transgène est associée à des modifications de la structure du génome (c.-à-d. délétions, insertions, inversions) pouvant entraîner une mutation récessive. Le mécanisme sous-jacent à cela n’est pas clair, mais peut impliquer des dommages physiques à la chromatine compactée par l’aiguille de micoinjection lors de l’injection du transgène d’ADN.

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