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Des essais de surveillance de réactions sélectionnées/multiples, réalisés sur des instruments triples quadripolaires, peuvent être couplés à la chromatographie en phase liquide pour l’analyse des digestes complexes de protéomes.

Dans les essais SRM / MRM, les premier (Q1) et dernier (Q3) analyseurs de masse d’un spectromètre de masse triple quadripolaire sont utilisés comme filtres de masse pour isoler un ion peptidique et un ion fragment correspondant. Le signal de l’ion fragment est ensuite surveillé sur le temps d’élution chromatographique (Fig. 1). La sélectivité résultant des deux étapes de filtrage, combinée au rapport cyclique élevé, conduit à des analyses quantitatives avec une sensibilité et une spécificité inégalées. Les paires spécifiques de valeurs m/z associées aux ions précurseurs et fragments sélectionnés sont appelées  » transitions » et constituent effectivement des dosages spectrométriques de masse permettant d’identifier et de quantifier un peptide spécifique et, par inférence, la protéine correspondante dans un digest protéique complexe.

Figure 1.

Le processus d’établissement d’un dosage SRM/ MRM pour une protéine comprend un certain nombre d’étapes:
1. Sélection du ou des peptides appropriés, uniques à la protéine d’intérêt et présentant une réponse du signal de spectrométrie de masse élevée (peptides protéotypiques, PTPs), pour maximiser la sensibilité du test
2. Sélection de fragments peptidiques prédominants spécifiques du peptide d’intérêt à utiliser dans la transition MRM
3. Éventuellement, pour chaque paire peptide-fragment, optimisation de paramètres MS spécifiques (par exemple l’énergie de collision) pour maximiser la réponse / sensibilité du signal
4. Validation du dosage MRM pour confirmer l’identité peptidique, par example en acquérant un spectre MS2 complet du peptide dans l’instrument triple quadripolaire utilisé pour MRM
5. Extraction des « coordonnées » finales du dosage MRM, y compris le peptide et les fragments peptidiques sélectionnés, les rapports masse/charge correspondants, les rapports d’intensité des fragments, l’énergie de collision associée et le temps d’élution chromatographique à utiliser éventuellement dans des analyses MRM à contraintes temporelles

Dans l’ensemble, il s’agit d’un processus long et itératif, mais, une fois qu’un dosage MRM pour une protéine est établi, il devient universellement utile, i.e. le processus fastidieux de développement du dosage ne doit être effectué qu’une seule fois, pour un type donné de spectromètre de masse et de mécanisme de fragmentation (par exemple, dissociation induite par collision).

Dans le MRMAtlas, chaque dosage protéique est présenté comme un ensemble de coordonnées MRM optimales pour le(s) peptide(s) qui représentent une protéine. Les identifications peptidiques ont été validées par l’acquisition des spectres de masse tandem correspondants sur le spectromètre de masse triple quadripôle, qui peuvent être considérés comme des spectres simples ou consensuels. Les coordonnées finales du test peuvent être téléchargées directement au format tableau Excel qui peut être directement collé dans une méthode MRM / SRM d’un instrument triple quadripolaire et utilisé pour détecter et quantifier spécifiquement la protéine d’intérêt dans un digest de protéines complexes.

(Adapté de: A. Schimdt, P. Picotti et R. Aebersold Proteomeanalyse und systembiologie BIOspektrum, 1/2008, S. 44)

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