마이크로 주입 서비스

  • 배경
  • 주문
  • 처리 시간
  • 성능 보장
  • 서비스 설명
  • 마우스 변형 고려 사항
  • 번식 형질 전환 설립자

배경

이후 1980 년 형질 전환 마우스는 수정란의 핵에 유전자 용액을 주입하여 일상적으로 생성되었습니다. 주입된 난자의 비율로,유전자는 염색체 중 하나에 통합됩니다. 생식 세포를 포함하여이 수정란에서 내림차순 세포는 형질 유전자를 포함 할 수 있습니다. 트랜스젠을 가진 마우스는 마우스 발달,번식 또는 항상성에 대한 트랜스젠의 영향을 조사하기 위해 사육 및 분석 될 수 있습니다.

마우스는 비교적 적은 수의 동물로부터 많은 수의 수정란을 쉽게 수집할 수 있기 때문에 이 절차에 특히 적합하다. 난자를 생산하기 위해 난자 기증자에게는 46-48 시간 간격으로 두 번의 호르몬 주사가 주어집니다. 이 과정(과배란이라고 함)은 그들이 일반적인 계란 수 이상을 방출하고 짝짓기를 잘 받아들입니다. 초호화 된 암컷 마우스는 비옥 한 수컷 마우스와 짝짓기를하고 다음날 아침 알을 수확합니다.

수정 직후 유전자 미세 주입이 수행된다. 마우스 알의 핵은 차동 간섭 대비 광학 장치를 사용하여 쉽게 시각화됩니다(오른쪽 이미지 참조). 수정란에는 각 배우자에서 하나씩 두 개의 핵이 있습니다. 주사 된 유전자는 염색체 복제 중에 주사 된 전 핵의 염색체에 통합 될 수 있습니다. 각 전 핵의 유전자가 복제 된 후,전핵 포락선이 분해되고,복제 된 염색체가 중기 판에 정렬되고 수정 된 난 모세포가 분열되어 2 세포 단계의 마우스 배아를 형성합니다.

유전자 주입 후 생존한 수정란을 수술로 가성임신 생쥐의 난관으로 옮긴다. 가성 임신 마우스는 비옥 한 암컷과 정관화 된 수컷을 교배하여 생산됩니다. 수컷은 멸균되어 있기 때문에 암컷은 자신의 수정 된 배아를 생산하지 않습니다. 그러나,짝짓기의 과정은 수술 전송 다음 수정란의 개발을 지원하기 위해 자신의 생식 기관을 자극한다. 만약 주입된 유전자가 염색체에 통합되어 있다면,주입된 난자의 이동으로 인한 자손은 그들의 몸 안에 있는 세포의 일부 또는 전부에 트랜스젠을 포함해야 한다.

마우스 새끼가 태어난 후 작은 조직 생검을 조달하고 유전자 유전자의 존재를 추출하여 분석합니다. 평균적으로,우리가 유전자 마이크로주사에서 생산한 생쥐의 약 15-20%가 트랜스젠에 대해 양성 반응을 보였다. 유전자 유전자를 운반하는 초기 마우스를’설립자'(또는 에프 0)형질 전환 동물. 유전자 변형 생쥐의 새로운 라인(균주)가 확립된다.

인기가 있지만,형질 전환 마우스를 생산하는이 방법은 몇 가지 단점이 있습니다(형질 전환 설립자 번식에 대한 아래 설명 참조). 이러한 문제를 극복하기 위해,우리는 이제 로사 26 과 11 의 유전자좌에 단일 복사 트랜스젠을 삽입하는 기능을 제공합니다. 동물 사이에 더 일관된 유전자 발현을 제공하는 것 외에도,이 방법은 조사자의 노력이 덜 필요합니다. 동등한 중요성으로,이 방법을 사용하여 실험을 수행하는 데 필요한 동물은 적습니다. 자세한 내용은 우리의 표적 전이 서비스에 대한 설명을 참조하십시오.

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주문

서비스 요청 양식에 대한 존 노이만에게 문의하십시오. 완성 된 양식은 수석 조사관이 서명해야합니다. 서명 된 양식은 메일을 통해 존 노이만에 전달 될 수있다,팩스,또는 스캔 한 이미지로.

서비스 신청서 외에도 다음과 같은 자료가 필요합니다:

  1. 당신의 플라스미드의 약 50 마이크로 그램을 포함하는 제한 다이제스트는 플라스미드 백본에서 트랜스 젠을 해제 할 수 있도록 잘라.
  2. 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 분석 된 다이제스트의 분취 사진,트랜스젠더 밴드가 명확하게 식별되었다.
  3. 당신이 생산하기를 희망하는 표현형과 구조에 대한 간략한 설명.
  4. 해당 기관의 동물 보호 및 사용위원회 및 동물 사용 프로토콜 및 재조합 유전자 프로토콜에 대한 생물 안전위원회의 승인 증거.
  5. 교외고객의 경우,귀하의 트랜스젠더의 이름을 포함한 물질 이전 계약이 중복 서명되었습니다.

당신의 유전자 구조를 준비하고 테스트하기 위한 팁과 프로토콜은 우리의 유전자 준비 및 구조 설계 페이지에서 찾을 수 있습니다.

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처리 시간

필요한 서류와 함께 마이크로 주입 준비가 된 구조물을 수령 한 후,고객에게 양도 할 수있는 형질 전환 설립자를 생산하는 데 필요한 최소 시간은 약 8 주입니다. 여기에는 난자 기증자를 주문하고 준비하는 데 약 2 주,임신 3 주,출생부터 이유까지 3 주가 포함됩니다.

참고-처리 시간이 더 길어질 수 있습니다,때문에 이전에 예약 된 주문 또는 때문에 첫 번째 주입에서 설립자를 생산하는 실패 중 하나. 지연은 또한 형질 전환 설립자를 식별하는 데 기술적 인 어려움으로 인해 발생할 수 있으며,이는 일반적으로 고객의 책임입니다. 처리 시간을 최소화하기 위해,우리는 최적화하고 강아지가 태어난 사전에 유전자형 프로토콜을 테스트하는 것이 좋습니다. 유전자 변형의 경우,유전자 변형의 특이성과 민감도를 테스트하여 마우스 꼬리에서 유전자로 희석시켜 단일 복사 유전자와 동등한 농도로 만듭니다. 길이가 3 킬로바이트인 트랜스젠의 경우,이것은 0 과 같습니다.100 나노 그램의 게놈 유전자 중 1 피코 그램.우리의 표준 유전자 마이크로 주입 서비스는 3 명의 유전자 변형 설립자 또는 총 50 마리의 새끼의 생산을 보장합니다. 이 서비스를 위해 우리는 먼저 2 일간의 유전자 주사를 시행합니다. 생성 된 자손의 조직 보피가 형질 유전자의 존재에 대해 분석 된 후,필요에 따라 추가 일의 미세 주입이 계획된다.

우리의 1 일 마이크로 주입 서비스는,이름에서 알 수 있듯이,주입의 1 일에 완료 될 수 있도록 설계 되었습니다. 이 서비스는 계란 및 새끼의 낮은 수확량이 수시로 계란 및 새끼의 낮은 수확량에서 얻어지더라도,이 균주를 위해 제안됩니다. 우리가 이 서비스에서 어떤 새끼 또는 창시자든지 일으키는 것을 보장하지 않는 동안,주입의 1 일이 적어도 1 명의 형질 전환 창시자를 일으키지 못하고 그 일을 위한 계란 수확량이 비정상적으로 낮으면(동일한 배경에 마지막 25 의 주입을 위한 평균의 밑에 1 개 이상 표준 편차),우리는 추가 비용 없이 그것을 한 번 반복할 것입니다.

두 서비스의 잠재적 사용자는 트랜스젠의 존재가 트랜스젠의 발현을 보장하지 않는다는 것을 알고 있어야 한다.

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서비스 설명

표준 및 1 일 서비스는 모두 다음과 같습니다:

  • 계란 기증자의 구매.
  • 난자 기증자의 과배란 및 스터드 수컷과의 짝짓기.
  • 정관수술을 받은 여성과 정관수술을 받은 남성을 교배하고,주사의 아침에 질마개를 검사하여 가성임신 수양모 생산.
  • 안락사 기증자로부터 난자 수확.
  • 각 수정란 중 하나의 핵에 이 용액을 주입하여 주입 완충액으로 환자의 형질전자를 희석시킨다.
  • 주사 과정에서 살아남은 모든 난자를 의사 임신 수양 어머니의 난관으로 옮깁니다.
  • 새끼 출생 전후의 수양 어머니 모니터링.
  • 원위 발가락 클리핑,섹싱 및(필요한 경우)약 10 일의 꼬리 절단에 의해 각 깔짚에 새끼를 표시합니다.
  • 유전형 분석을 위해 발가락 또는 꼬리 생검을 클라이언트로 옮깁니다.
  • 고객에게 형질 전환 된 새끼의 이유,식별 및 양도 또는 선적.

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어떤 마우스 변형을 사용해야합니까?

우리는 2 개의 난자 기증자를 일상적으로 제공합니다. 서비스 요금 때문에 이러한 균주 중 계란과 강아지 수율의 차이의 변형에 따라 다릅니다.난자 기증자와 스터드 수컷은 잭슨 연구소(잭스)에서 구입한다. 수컷 및 암컷이 미세주사를 위해 수정란을 생산하기 위해 우리 시설에서 교배되는 경우,알과 새끼는 수컷 및 암컷을 수컷 및 암컷을 수컷 및 암컷을 수컷 및 암컷을 수컷 및 암컷을 수컷 및 암컷을 수컷 및 암컷을 수컷 및 암컷을 수컷 및 암컷을 수컷 및 암컷을 수컷 및 암컷이라고 합니다. 염색체의 각 쌍은 하나의 염색체와 하나의 염색체로 구성됩니다. 반면,그들의 자식은 감수 재조합으로 인해 유전적으로 동일하지 않으며,다양한 코트 색상을 가질 것이다.더 낮은 계란 및 강아지 수확량을 일으키기 때문에 더 비싸다. 그러나,그 전이 율(형질 전환 된 새끼의 비율)은 우리가 일상적으로 제공하는 다른 균주와 거의 같습니다(모든 새끼의 약 15-20%가 형질 전환). 니코틴아미드 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제(니코틴아미드 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제)를 함유한 야생형입니다. 더 자세한 정보는 온라인에서 확인할 수 있다.

다른 균주를 난자 기증자로 사용할 수 있지만 일반적으로 추가 비용이 필요합니다. 일부 라인은 매우 빈약 한 기증자이며 가능한 경우 피해야합니다. 난자 기증자로 사용하기 위해 주어진 균주의 적합성에 대한 데이터가 없거나 문제가있는 것으로 알려진 경우 1 일 서비스 만 제공 할 수 있습니다.

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번식 형질 전환 설립자

프로 핵에 마이크로 주입 될 때,트랜스 유전자는 게놈에 무작위로 통합됩니다. 따라서 각 설립자는 서로 다른 통합 사이트를 갖게됩니다. 각 설립자가 소유 한 트랜스제너의 사본 수는 다를 수 있으며 게놈 내에 하나 이상의 통합 사이트가있을 수 있습니다. 또한 일부 창립자는 트랜스 젠에 대한 모자이크 일 수 있습니다. 이러한 이유로 각 설립자는 별도의 라인으로 취급되어야하며 동일한 트랜스 젠을 가지고있는 다른 설립자와 독립적으로 사육되어야합니다(즉,설립자를 서로 짝짓기하지 마십시오).

트랜스젠의 전염과 발현을 시험하기 위해 각 설립자로부터 자손을 얻어야 한다. 위치 효과와 다른 사본 번호로 인해 각 설립자 라인은 다른 수준의 표현을 가질 수 있습니다. 실제로,우리는 트랜스젠의 어떤 표현도 얻을 수 있다고 보장 할 수 없습니다. 유전자 구조에서 절연체 서열을 사용하면 이러한 발생을 방지 할 수 있습니다.

트랜스젠이 반드시 특정 설립자에 의해 멘델의 방식으로 전달되는 것은 아니다. 설립자는 첫 번째 세포 분열 후에 통합이 발생하면 트랜스 젠에 대한 모자이크가 될 수 있습니다. 모자이크주의는 1 세대 자손에서 50%미만의 상속 빈도를 초래할 수 있습니다. 일부 설립자의 경우,트랜스젠은 하나 이상의 궤적에 통합되어 50%이상의 상속 빈도를 초래할 수 있습니다. 이 경우 1 세대 자손 간의 표현 수준은 상속되는 통합 사이트에 따라 다를 수 있습니다.

덜 흔한 문제는 감수 재조합에 의해 야기될 수 있는 형질전환자의 손실이다. 때때로,트랜스젠더 발현은 메틸화로 인해 후속 세대에서 차단될 수 있으며,이는 대부분의 트랜스젠더가 트랜스젠더의 여러 복사본을 포함하는 머리-꼬리 연결체로 삽입된다는 사실과 연결될 수 있다. 우리는 이제 무작위로 삽입 된 트랜스 유전자와 관련 된 문제를 제거 하는 상 동성 재조합을 사용 하 여 유전자 변형 쥐를 만드는 다른 방법을 제공 합니다. 우리의 표적 전이 서비스를 참조하십시오.난자 기증자의 근친 라인을 사용하는 경우(즉. 이 경우,클라이언트는 근친 선으로 백크로스할지,혼합 배경을 유지할지 여부를 결정해야 합니다.

한 염색체에 형질전자를 가진 쥐는 다른 염색체에 상응하는 대립 유전자가 없기 때문에”반 접합체”라고 불린다. 많은 경우에 동형 접합체 형질 전이를 생성 할 수 있으며,이들은 대응하는 반 접합체 마우스보다 높은 수준의 발현을 가질 수 있지만,동형 접합체와 반 접합체를 구별하는 것은 어려울 수 있습니다. 양적 유전자형 분석법을 사용해야합니다(예:양적 피시험자 또는 남부 블로 팅). 또는 의심되는 동형 접합체를 야생형 마우스로 교차시키고 모든 자손이 반 접합체인지 확인하기 위해 테스트 할 수 있습니다.

마지막으로,조사자는 약 10%의 경우에서 형질 유전자의 통합이 열성 돌연변이를 유발할 수있는 게놈 구조의 변화(즉,삭제,삽입,반전)와 관련이 있음을 알고 있어야합니다. 이 기본 메커니즘은 분명하지 않지만 유전자 형질전자를 주입하는 동안 미세 주사 바늘에 의해 압축 된 염색질에 물리적 손상을 포함 할 수 있습니다.

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