DNA Microinjection Diensten

  • Achtergrond
  • Bestellen
  • Doorlooptijden
  • Prestaties Garandeert
  • Service Description
  • Muis Stam Overwegingen
  • Fokken van Transgene Oprichters

Achtergrond

Sinds 1980 transgene muizen hebben routinematig zijn gegenereerd door het injecteren van een oplossing van DNA in een pronucleus van een bevruchte eicel. In een deel van geïnjecteerde eieren, wordt het DNA geïntegreerd in een van de chromosomen. Cellen die afstammen van dit bevruchte ei, inclusief kiemcellen, kunnen het transgen-DNA bevatten. Muizen met het transgen kunnen gefokt en geanalyseerd worden om het effect van het transgen op de ontwikkeling, reproductie of homeostase van muizen te onderzoeken.

muizen zijn bijzonder geschikt voor deze procedure omdat het gemakkelijk is om grote aantallen bevruchte eieren van een relatief klein aantal dieren te verzamelen. Om eieren te produceren, krijgen de eiceldonoren twee hormooninjecties met een tussenruimte van 46-48 uur. Dit proces (genoemd superovulation) veroorzaakt hen om meer dan het gebruikelijke aantal eieren vrij te geven en ontvankelijk voor het paren te worden. De superovulated vrouwtjesmuizen worden gedekt met vruchtbare mannetjesmuizen en de eieren worden de volgende ochtend geoogst.

micro-injectie van DNA wordt kort na de bevruchting uitgevoerd. De pronuclei van muizeneieren worden gemakkelijk gevisualiseerd met behulp van differentiële interferentie Contrast (DIC) optiek (zie afbeelding rechts). Bevruchte eieren hebben twee pronuclei, één van elke gamete. Ingespoten DNA kan in chromosomen in ingespoten pronucleus tijdens chromosoomreplicatie integreren. Nadat DNA in elke pronucleus heeft gedupliceerd, breken de pronucleaire enveloppen af, richten de gedupliceerde chromosomen zich op de metafaseplaat en deelt de bevruchte eicel zich om een embryo van de tweecellige stadiummuis te vormen.

na injectie met DNA worden overlevende bevruchte eieren operatief overgebracht naar de eileiders van pseudopregnante muizen. Pseudopregnante muizen worden geproduceerd door vruchtbare vrouwtjes te paren met gesteriliseerde mannetjes. Omdat de mannetjes steriel zijn, produceren de vrouwtjes zelf geen bevruchte embryo ‘ s. Het paringsproces stimuleert echter hun voortplantingskanaal om de ontwikkeling van bevruchte eieren na chirurgische overdracht te ondersteunen. Als het geïnjecteerde DNA in een chromosoom is geïntegreerd, moeten de nakomelingen die het gevolg zijn van de overdracht van de geïnjecteerde eieren het transgen in sommige of alle cellen in hun lichaam bevatten.

na de geboorte van muizenjongen wordt een kleine weefselbiopsie verkregen en wordt DNA geëxtraheerd en geanalyseerd op de aanwezigheid van transgeen. Gemiddeld is ongeveer 15-20% van de muizen die we hebben geproduceerd met DNA micro-injectie positief getest op het transgen. De eerste muizen die het transgene dragen worden ‘founder’ (of F0) transgene dieren genoemd. De F0 muizen worden vervolgens gedekt met wild type muizen om F1 nakomelingen te identificeren die het transgene bevatten en nieuwe lijnen (stammen) van transgene muizen worden vastgesteld.

hoewel deze methode om transgene muizen te produceren populair is, heeft deze methode een aantal nadelen (zie de discussie hieronder over het fokken van transgene oprichters). Om deze te overwinnen, bieden we nu de mogelijkheid om single-copy transgenen in te voegen in de rosa26 en H11 loci. Naast het verstrekken van meer consistente genexpressie tussen dieren, vereist deze methode minder inspanning van de kant van de onderzoeker. Even belangrijk is dat er minder dieren nodig zijn om experimenten met deze methode uit te voeren. Voor meer informatie zie de beschrijving van onze gerichte transgenese service.

terug naar boven

bestellen

neem contact op met Jon Neumann voor een Service aanvraagformulier. Het ingevulde formulier moet door de hoofdonderzoeker worden ondertekend. Ondertekende formulieren kunnen bij Jon Neumann worden afgeleverd via mail, fax of als gescande afbeelding.

naast het aanvraagformulier voor diensten zijn de volgende materialen vereist: :

  1. een restrictiesamenvatting die ongeveer 50 microgram van uw plasmide bevat, zodat het transgeen uit de plasmide-ruggengraat vrijkomt.
  2. een foto van een aliquot van de digest geanalyseerd met agarosegelelektroforese, waarbij de transgenband duidelijk is geïdentificeerd.
  3. een korte beschrijving van de constructie en het fenotype dat u hoopt te produceren.
  4. bewijs van goedkeuring door het Animal Care and Use Committee en het Biosafety Committee van uw instelling voor het gebruik van uw dierprotocol en het recombinant-DNA-protocol.
  5. voor klanten buiten de campus, een Materiaaloverdrachtovereenkomst, met inbegrip van de naam(namen) van uw transgene(n), ondertekend in tweevoud.

Tips en protocollen voor het voorbereiden en testen van uw DNA-constructie zijn te vinden op onze pagina ‘ s over DNA-voorbereiding en-constructie.

terug naar boven

doorlooptijden

na ontvangst van een constructie die klaar is voor micro-injectie, samen met het nodige papierwerk, is de minimale tijd die nodig is om transgene oprichters te produceren die aan de cliënt kunnen worden overgedragen ongeveer 8 weken. Dit omvat ongeveer 2 weken om de eiceldonoren te bestellen en voor te bereiden, 3 weken drachttijd en 3 weken vanaf de geboorte tot het spenen.

houd er rekening mee dat de doorlooptijd langer kan zijn, hetzij vanwege eerder geplande orders, hetzij omdat de oprichters niet bij de eerste injectie zijn geproduceerd. Vertragingen kunnen ook worden veroorzaakt door technische problemen bij het identificeren van transgene oprichters, die in het algemeen de verantwoordelijkheid van de klant is. Om doorlooptijden te minimaliseren, raden we aan om uw genotyperingsprotocol ruim voor de geboorte van pups te optimaliseren en te testen. Voor PCR-tests, test de specificiteit en gevoeligheid door uw transgene te verdunnen tot genomisch DNA van muizenstaarten (beschikbaar via het TMF), tot een concentratie die gelijkwaardig is aan een enkelkopiegen. Voor een transgene die 3 kb lang is, zou dit gelijk zijn aan 0.1 picogram van transgene in 100 nanogrammen van genomisch DNA.

terug naar boven

Prestatiegaranties

onze standaard DNA-Microinjectiedienst garandeert de productie van 3 transgene oprichters of 50 pups in totaal, afhankelijk van wat het eerst komt. Voor deze service voeren we eerst twee dagen DNA-injectie uit. Na weefselbopten van de resulterende nakomelingen worden onderzocht op de aanwezigheid van het transgen, extra dagen van micro-injectie worden gepland als dat nodig is.

onze eendaagse DNA-Microinjectiedienst is, zoals de naam al aangeeft, ontworpen om in één dag injectie te worden voltooid. Deze service wordt aangeboden voor de b6sjlf2/J en de c57bl/6NJ stam, hoewel lage opbrengsten van eieren en jongen vaak worden verkregen uit de c57bl / 6NJ stam. Hoewel we niet garanderen om pups of oprichters van deze service te produceren, als een dag van de injectie niet ten minste 1 transgene stichter te produceren en de eicelopbrengst voor die dag ongewoon laag was (meer dan één standaarddeviatie Onder het gemiddelde voor de laatste 25 injecties op dezelfde achtergrond), zullen we dit één keer herhalen zonder extra kosten.

potentiële gebruikers van beide diensten dienen zich ervan bewust te zijn dat de aanwezigheid van een transgeen niet garandeert dat het transgeen tot uitdrukking komt.

terug naar boven

Servicebeschrijving

zowel de standaard-als de eendaagse diensten omvatten:

  • aankoop van eiceldonoren.
  • Hyperovulatie van eiceldonoren en paring met de stud mannetjes.
  • productie van pseudopregnante pleegmoeders door paring van ingeteelde ICR-vrouwen met gesteriliseerde mannetjes en controle op Vaginale pluggen op de ochtend van de injectie.
  • oogsten van eieren van geëuthanaseerde donoren.
  • verdunning van het transgen-DNA van de cliënt met injectiebuffer tot een concentratie van 2 ng/ul en injectie van deze oplossing in één pronucleus van elk bevrucht ei.
  • overdracht van alle eieren die het injectieproces overleven in de eileiders van pseudopregnante pleegmoeders.
  • controle van pleegmoeders voor en na de geboorte van pups.
  • het markeren van pups in elk nest door het knippen van de distale teen, geslachtsdelen en (indien nodig) het knippen van de staart op de leeftijd van ongeveer tien dagen.
  • overdracht van teenbiopten of staartbiopten aan de cliënt voor genotypering.
  • spenen, identificatie en overdracht of verzending van transgene jongen naar de cliënt.

terug naar boven

welke Muisstam moet ik gebruiken ?

wij bieden 2 stammen van eiceldonoren op een routine basis. De service fee varieert per soort vanwege verschillen in ei en pup opbrengsten tussen deze soorten.

de stam met de hoogste opbrengsten is de hybride stam, B6sjlf2/J. eiceldonoren en dekkmannetjes worden gekocht bij het Jackson Lab (Jax), waar ze worden geproduceerd door c57bl/6J vrouwtjes te paren met SJL/J mannetjes. Wanneer b6sjlf1 / J mannetjes en vrouwtjes worden gedekt in onze faciliteit om bevruchte eieren voor micro-injectie te produceren, worden de eieren en resulterende pups aangeduid als B6SJLF2. B6sjlf1 / J muizen zijn genetisch identiek – elk paar chromosomen bestaat uit één c57bl/6J chromosoom en één SJL/J chromosoom. In tegenstelling, zijn hun b6sjlf2 Nakomelingen, terwijl zij nog ongeveer 50% C57BL/6J en 50% SJL/J zijn, genetisch niet identiek vanwege meiotische recombinatie, en zullen een verscheidenheid van vachtkleuren hebben.

de c57bl / 6NJ-stam is duurder omdat ze een lagere opbrengst van eieren en jongen produceert. Echter, het percentage transgenese (percentage van de pups die transgeen zijn) is ongeveer hetzelfde als de andere stammen die we routinematig aanbieden (ongeveer 15-20% van alle pups zijn transgeen). Houd er rekening mee dat in tegenstelling tot de c57bl/6J-stof, C57BL/6NJ wild type is voor het NNT-gen (nicotinamide nucleotide transhydrogenase). Meer details over de c57bl / 6J substrain zijn online te vinden.

hoewel andere stammen als eiceldonor kunnen worden gebruikt, zijn hiervoor meestal extra kosten nodig. Sommige lijnen zijn zeer slechte donoren en moeten indien mogelijk worden vermeden (bijvoorbeeld BALB/c en DBA/2J). Als er geen gegevens beschikbaar zijn over de geschiktheid van een bepaalde stam voor gebruik als eiceldonor, of als bekend is dat het problematisch is, kunnen we alleen de eendaagse service aanbieden.

Back to Top

fokken transgene oprichters

wanneer micro-injectie in pronuclei wordt uitgevoerd, worden transgenen willekeurig in het genoom geïntegreerd. Zo zal elke oprichter een andere site(s) van integratie hebben. Het aantal exemplaren van transgene bezeten door elke stichter kan ook verschillend zijn en er kan meer dan één plaats van integratie binnen het genoom zijn. Ook kunnen sommige stichters mozaïek zijn voor de transgen. Om deze redenen moet elke oprichter als een aparte lijn worden behandeld en onafhankelijk van andere oprichters worden gefokt die dezelfde transgene dragen (dat wil zeggen, paren oprichters niet met elkaar).

nakomelingen moeten van elke stichter worden verkregen om de overdracht en expressie van het transgeen te testen. Door positie-Effecten en verschillende kopieernummers kan elke stichterlijn een ander niveau van expressie hebben. Inderdaad, we kunnen niet garanderen dat er enige uitdrukking van de transgene zal worden verkregen. Gebruik van isolatorsequenties in een transgen constructie kan helpen voorkomen dat dergelijke ocurrences.

het transgeen zal niet noodzakelijk op Mendeliaanse wijze worden overgedragen door een bepaalde stichter. De oprichters kunnen mozaïek voor transgen zijn, als de integratie na de eerste celdeling voorkomt. Mosaicisme kan resulteren in een frequentie van overerving van minder dan 50% in de eerste generatie nakomelingen. In sommige oprichters, kan transgene in meer dan één plaats integreren, resulterend in een frequentie van overerving van meer dan 50%. In dit geval kunnen de expressieniveaus onder de nakomelingen van de eerste generatie variëren, afhankelijk van welke integratieplaats ze erven.

een minder vaak voorkomend probleem is het verlies van het transgeen, dat kan worden veroorzaakt door meiotische recombinatie. Af en toe, transgene expressie kan worden uitgeschakeld in volgende generaties toe te schrijven aan methylation, die kan worden verbonden met het feit dat de meeste transgenen worden ingevoegd als head-to-tail concatemers met meerdere kopieën van de transgene. We bieden nu andere methoden voor het maken van transgene muizen, met behulp van homologe recombinatie op de rosa26 en H11 loci, die de problemen in verband met willekeurig ingevoegde transgenen elimineert. Zie onze gerichte transgenese service.

als een inteeltlijn van eiceldonoren wordt gebruikt (d.w.z. C57BL/6NJ), moeten de oprichters op dezelfde achtergrond worden gefokt om de inteeltstatus te behouden. Voor oprichters van de hybride b6sjlf2 / J stam, moet de klant beslissen of hij terug kruist naar een inteelt lijn, of om een gemengde achtergrond te behouden.

muizen die het transgeen op één chromosoom hebben, worden hemizygous genoemd omdat ze geen overeenkomstig allel op het andere chromosoom hebben. In veel gevallen is het mogelijk om homozygote transgenics te produceren, en deze kunnen een hoger niveau van expressie hebben dan de corresponderende hemizygous muizen, maar het onderscheiden van homozygoten van hemizygoten kan moeilijk zijn. Er moet een kwantitatieve genotyperingstest worden gebruikt (bv. kwantitatieve PCR of Zuidelijke bevleking). Als alternatief kunnen verdachte homozygoten worden gekruist met wildtype muizen en alle nakomelingen worden getest om te zien of ze hemizygous zijn.

ten slotte moeten de onderzoekers zich ervan bewust zijn dat in ongeveer 10% van de gevallen integratie van het transgeen gepaard gaat met veranderingen in de genoomstructuur (d.w.z. deleties, inserties, inversies) die kunnen leiden tot een recessieve mutatie. Het onderliggende mechanisme is niet duidelijk, maar kan fysieke schade aan gecomprimeerde chromatine door de micoinjectienaald tijdens injectie van het DNA transgene.

terug naar boven

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.