SRMAtlas Home

wybrane/wielokrotne testy monitorowania reakcji, prowadzone na potrójnych czworupolowych instrumentach, mogą być sprzężone z chromatografią cieczową w celu analizy złożonych digestów proteomu.

w testach SRM/MRM pierwszy (Q1) i ostatni (Q3) analizator masy potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego stosuje się jako filtry masowe do izolowania jonu peptydowego i odpowiedniego jonu fragmentarycznego. Sygnał jonu fragmentu jest następnie monitorowany przez czas elucji chromatograficznej (Fig. 1). Selektywność wynikająca z dwóch etapów filtrowania, w połączeniu z wysokim cyklem pracy, skutkuje analizami ilościowymi o niezrównanej czułości i specyficzności. Specyficzne pary wartości m / z związane z wybranymi jonami prekursorowymi i fragmentarycznymi są określane jako „przejścia” i skutecznie stanowią testy spektrometryczne mas, które pozwalają zidentyfikować i określić ilościowo specyficzny peptyd oraz, poprzez wnioskowanie, odpowiednie białko w złożonym procesie trawienia białek.

Rysunek 1.

proces tworzenia testu SRM/MRM dla białka składa się z kilku etapów:
1. Wybór odpowiedniego peptydu/s, unikalnego dla białka będącego przedmiotem zainteresowania i wykazującego wysoką odpowiedź sygnału spektrometrii masowej (peptydy proteotypowe, PTPs), w celu zmaksymalizowania czułości testu
2. Wybór dominujących fragmentów peptydowych specyficznych dla peptydu będącego przedmiotem zainteresowania, do zastosowania w przejściu MRM
3. Ostatecznie, dla każdej pary peptyd-fragment, optymalizacja określonych parametrów MS (np. energii zderzenia) w celu zmaksymalizowania odpowiedzi/czułości sygnału
4. Walidacja testu MRM w celu potwierdzenia tożsamości peptydowej, np. poprzez uzyskanie pełnego spektrum MS2 peptydu w potrójnym kwadrupolowym przyrządzie stosowanym dla MRM
5. Ekstrakcja końcowych „współrzędnych” testu MRM, w tym wybranych peptydów i fragmentów peptydowych, odpowiednich współczynników masy do ładunku, współczynników intensywności fragmentu, związanej z tym energii zderzenia i czasu elucji chromatograficznej, które można opcjonalnie wykorzystać w ograniczonych czasowo analizach MRM

Ogólnie rzecz biorąc, jest to długi i iteracyjny proces, ale po ustaleniu testu MRM dla białka staje się on uniwersalny, tj. żmudny proces opracowywania testu musi być przeprowadzony tylko raz, dla danego typu spektrometru masowego i mechanizmu fragmentacji (np. kolizja indukowana-dysocjacja).

W teście MRMAtlas każde białko przedstawia się jako zestaw optymalnych współrzędnych MRM dla peptydu (- ów) reprezentującego (- ych) białko. Identyfikacja peptydów została potwierdzona poprzez uzyskanie odpowiednich widm masowych tandemowych na potrójnym spektrometrze masowym kwadrupolowym, które można postrzegać jako widmo pojedyncze lub konsensusowe. Końcowe współrzędne testu można bezpośrednio pobrać w formacie tabeli Excel, który można bezpośrednio wkleić do metody MRM / SRM potrójnego przyrządu kwadrupolowego i użyć do specyficznego wykrywania i ilościowego określenia białka będącego przedmiotem zainteresowania w złożonym procesie trawienia białek.

(na podstawie: A. Schimdt, P. Picotti i R. Aebersold Proteomeanalyse und systembiologie BIOspektrum, 1/2008, S. 44)

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.