Usługi mikroiniekcji DNA

  • Tło
  • zamawianie
  • czas realizacji
  • Gwarancje wydajności
  • Opis Usługi
  • rozważania dotyczące szczepu myszy
  • Hodowla transgenicznych założycieli

Tło

od 1980 transgeniczne myszy rutynowo były generowane przez wstrzyknięcie roztworu DNA do Pronukleusa zapłodnionego jaja. W proporcji wstrzykniętych jaj DNA zostaje zintegrowane z jednym z chromosomów. Komórki z tego zapłodnionego jaja, w tym komórki zarodkowe, mogą zawierać transgenowe DNA. Myszy z transgenem można hodować i analizować w celu zbadania wpływu transgenu na rozwój myszy, reprodukcję lub homeostazę.

myszy są szczególnie odpowiednie do tej procedury, ponieważ łatwo jest zebrać dużą liczbę zapłodnionych jaj od stosunkowo niewielkiej liczby zwierząt. Aby wyprodukować jaja, dawcy jaj otrzymują dwa zastrzyki hormonalne w odstępie 46-48 godzin. Proces ten (zwany superowulacją) powoduje, że uwalniają więcej niż zwykle liczbę jaj i stają się podatne na krycie. Superowulowane samice myszy są połączone z płodnymi samcami, a jaja są zbierane następnego ranka.

mikroiniekcję DNA przeprowadza się krótko po zapłodnieniu. Pronuclei jaj myszy są łatwo wizualizowane za pomocą optyki DIC (Differential Interference Contrast) (patrz obraz po prawej stronie). Zapłodnione jaja mają dwa przedjądra, po jednym z każdej gamety. Wstrzyknięte DNA może integrować się z chromosomami w wstrzykniętym pronucleus podczas replikacji chromosomu. Po dna w każdym pronucleus ma duplikowane, pronuclear koperty rozbić, duplikowane chromosomy wyrównać na płytce metafazy i zapłodnione oocyte dzieli się tworząc zarodek myszy Stadium dwukomórkowego.

po wstrzyknięciu DNA, ocalałe zapłodnione jaja są chirurgicznie przenoszone do jajowodów myszy rzekomobłoniastych. Pseudopregnant myszy są produkowane przez kojarzenie płodnych samic z wazektomizowanych samców. Ponieważ samce są bezpłodne, samice nie produkują własnych zarodków. Jednak proces kojarzenia stymuluje ich drogi rozrodcze do wspierania rozwoju zapłodnionych jaj po przeniesieniu chirurgicznym. Jeśli wstrzyknięte DNA zintegrowało się z chromosomem, potomstwo powstałe w wyniku przeniesienia wstrzykniętych komórek jajowych powinno zawierać transgen w niektórych lub wszystkich komórkach w ich ciałach.

po urodzeniu szczeniąt myszy pobiera się małą biopsję tkanki, a DNA jest ekstrahowane i analizowane pod kątem obecności transgenu. Średnio około 15-20% myszy, które wyprodukowaliśmy z mikroiniekcji DNA, ma pozytywny wynik na obecność transgenu. Początkowe myszy przenoszące transgen nazywane są „założycielami” (lub F0) zwierząt transgenicznych. Myszy F0 są następnie łączone z myszami dzikiego typu w celu identyfikacji potomstwa F1 zawierającego transgen i ustanawia się nowe linie (szczepy) myszy transgenicznych.

chociaż popularna, ta metoda produkcji myszy transgenicznych ma pewne wady (patrz dyskusja poniżej na temat hodowli transgenicznych założycieli). Aby je przezwyciężyć, oferujemy teraz możliwość wstawiania pojedynczych kopii transgenów do loci ROSA26 i H11. Oprócz zapewnienia bardziej spójnej ekspresji genów między zwierzętami, metoda ta wymaga mniej wysiłku ze strony badacza. Równie ważne jest, że mniej zwierząt jest wymaganych do przeprowadzania eksperymentów przy użyciu tej metody. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z opisem naszej usługi ukierunkowanej Transgenezy.

powrót na górę

zamawianie

skontaktuj się z Jonem Neumannem, aby uzyskać formularz zgłoszenia serwisowego. Wypełniony formularz musi być podpisany przez głównego badacza. Podpisane formularze mogą być dostarczone do Jona Neumanna pocztą, faksem lub jako zeskanowany obraz.

oprócz formularza zgłoszenia serwisowego wymagane są następujące materiały:

  1. trawienie restrykcyjne zawierające około 50 mikrogramów plazmidu, pocięte tak, aby uwolnić transgen ze szkieletu plazmidu.
  2. zdjęcie fragmentu trawienia analizowanego elektroforezą w żelu agarozowym, z wyraźnie zidentyfikowanym pasmem transgenu.
  3. Krótki opis konstrukcji i fenotypu, który chcesz wyprodukować.
  4. dowody zatwierdzenia protokołu stosowania leku u zwierząt i protokołu rekombinacji DNA przez Komitet ds.
  5. dla klientów spoza kampusu, Umowa o przekazaniu materiałów, w tym imię i nazwisko (- a) twojego transgenu (- ów), podpisana w dwóch egzemplarzach.

wskazówki i protokoły dotyczące przygotowywania i testowania konstrukcji DNA można znaleźć na naszych stronach do przygotowywania i testowania konstrukcji DNA.

do góry

czasy realizacji

po otrzymaniu konstrukcji gotowej do mikroiniekcji wraz z niezbędnymi dokumentami, minimalny czas potrzebny na wyprodukowanie transgenicznych założycieli, które mogą być przekazane Klientowi, wynosi około 8 tygodni. Obejmuje to około 2 tygodni na zamówienie i przygotowanie dawców jaj, 3 tygodnie ciąży i 3 tygodnie od urodzenia do odsadzenia.

Uwaga – czas realizacji może być dłuższy, albo z powodu wcześniej zaplanowanych zamówień, albo z powodu braku produkcji Od pierwszego wtrysku. Opóźnienia mogą być również spowodowane trudnościami technicznymi w identyfikacji transgenicznych założycieli, co jest zazwyczaj obowiązkiem klienta. Aby zminimalizować czas realizacji, zalecamy optymalizację i testowanie protokołu genotypowania na długo przed narodzinami szczeniąt. W przypadku testów PCR należy sprawdzić swoistość i czułość poprzez rozcieńczenie transgenu do genomowego DNA z ogonów myszy (dostępnych w TMF), aż do stężenia równoważnego genowi z pojedynczą kopią. Dla transgenu o długości 3 kb byłoby to równe 0.1 pikogram transgenu w 100 nanogramach genomowego DNA.

do góry

Gwarancje wydajności

nasza standardowa usługa mikroiniekcji DNA gwarantuje produkcję 3 transgenicznych założycieli lub 50 szczeniąt ogółem, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Dla tej usługi najpierw wykonujemy dwa dni zastrzyku DNA. Po przebadaniu tkanek potomstwa na obecność transgenu zaplanowano dodatkowe dni mikroiniekcji w razie potrzeby.

nasza jednodniowa usługa mikroiniekcji DNA jest, jak sama nazwa wskazuje, zaprojektowana do zakończenia w ciągu jednego dnia wstrzyknięcia. Ta usługa jest oferowana dla szczepu B6SJLF2/J i szczepu C57BL/6NJ, chociaż często uzyskuje się niskie plony jaj i szczeniąt ze szczepu C57BL / 6NJ. Chociaż nie gwarantujemy wyprodukowania żadnych szczeniąt lub założycieli z tej usługi, jeśli jeden dzień zastrzyku nie wytworzy co najmniej 1 transgenicznego założyciela, a wydajność jaj w tym dniu była wyjątkowo niska (więcej niż jedno odchylenie standardowe poniżej średniej dla ostatnich 25 zastrzyków na tym samym tle), powtórzymy to raz bez dodatkowych opłat.

potencjalni użytkownicy obu serwisów powinni mieć świadomość, że obecność transgenu nie gwarantuje jego ekspresji.

do góry

Opis Usługi

zarówno standardowe, jak i jednodniowe usługi obejmują:

  • zakup dawców jaj.
  • Hiperowulacja dawców jaj i kojarzenie z samcami stadnymi.
  • produkcja rzekomobłoniastych matek zastępczych poprzez kojarzenie samic ICR z samcami po wazektomii i sprawdzanie zatyczek dopochwowych rano po wstrzyknięciu.
  • zbieranie jaj od eutanazji dawców.
  • rozcieńczenie transgenowego DNA klienta buforem iniekcyjnym do stężenia 2 ng/ul i wstrzyknięcie tego roztworu do jednego pronukleusa każdego zapłodnionego jaja.
  • przeniesienie wszystkich jaj, które przetrwały proces iniekcji do jajowodów rzekomobożnych matek zastępczych.
  • monitorowanie matek zastępczych przed i po urodzeniu szczeniąt.
  • oznaczanie szczeniąt w każdym miocie przez dalsze obcinanie palców, seksowanie i (jeśli jest to wymagane) cięcie ogona w wieku około dziesięciu dni.
  • przeniesienie biopsji palców lub ogona do Klienta w celu genotypowania.
  • odstawienie, identyfikacja i przekazanie lub wysyłka szczeniąt transgenicznych do klienta.

do góry

jakiej odmiany myszy powinienem użyć ?

rutynowo oferujemy 2 szczepy dawców jaj. Opłata za usługę różni się w zależności od szczepu ze względu na różnice w plonach jaj i szczeniąt między tymi szczepami.

szczepem o najwyższych plonach jest szczep Hybrydowy, B6SJLF2/J. dawcy jaj i samce stadne są kupowane w laboratorium Jacksona (Jax), gdzie są produkowane przez kojarzenie samic C57BL/6J z samcami SJL/J. Kiedy samce i samice B6SJLF1/J są łączone w naszym zakładzie w celu produkcji zapłodnionych jaj do mikroiniekcji, jaja i powstałe szczenięta są określane jako B6SJLF2. Myszy B6SJLF1 / J są genetycznie identyczne-każda para chromosomów składa się z jednego chromosomu C57BL / 6J i jednego chromosomu SJL/J. W przeciwieństwie do tego, ich potomstwo B6SJLF2, chociaż nadal jest w przybliżeniu 50% C57BL / 6J i 50% SJL / J, nie jest genetycznie identyczne z powodu rekombinacji mejotycznej i będzie miało różne kolory sierści.

szczep C57BL/6NJ jest droższy, ponieważ daje niższe plony jaj i szczeniąt. Jednak tempo transgenezy (odsetek szczeniąt transgenicznych) jest mniej więcej takie samo jak inne szczepy, które rutynowo oferujemy (około 15-20% wszystkich szczeniąt jest transgenicznych). Należy pamiętać, że w przeciwieństwie do podjednostki C57BL/6J, C57BL / 6NJ są typu dzikiego dla genu NNT (transhydrogenazy nukleotydów nikotynamidowych). Więcej informacji na temat podstrony C57BL/6J można znaleźć w Internecie.

podczas gdy inne szczepy mogą być używane jako dawcy jaj, zwykle wymagają one dodatkowych opłat. Niektóre linie są bardzo ubogimi dawcami i należy ich unikać, jeśli to możliwe (np. BALB/c i DBA/2j). Jeśli nie ma dostępnych danych na temat przydatności danego szczepu do wykorzystania jako dawcy jaj lub jeśli wiadomo, że jest to problematyczne, możemy zaoferować tylko usługę jednodniową.

powrót do góry

Hodowla założycieli transgenicznych

po mikroiniekcji do pronuclei, transgeny są losowo integrowane do genomu. W ten sposób każdy założyciel będzie miał inną witrynę(s) integracji. Liczba kopii transgenu posiadanych przez każdego założyciela może być również inna i może istnieć więcej niż jedno miejsce integracji w obrębie genomu. Również niektórzy założyciele mogą być mozaiką dla transgenu. Z tych powodów każdy założyciel powinien być traktowany jako osobna linia i hodowany niezależnie od innych założycieli noszących tę samą transgene (tzn. nie kojarzaj założycieli ze sobą).

potomstwo musi być uzyskane od każdego założyciela, aby przetestować transmisję i ekspresję transgenu. Ze względu na efekty pozycji i różne liczby kopii, każda linia założycielska może mieć inny poziom ekspresji. W rzeczy samej, nie możemy zagwarantować, że jakikolwiek wyraz transgenu zostanie uzyskany. Zastosowanie sekwencji izolatorów w konstrukcji transgenu może pomóc w zapobieganiu takim zjawiskom.

transgeny niekoniecznie będą przekazywane w sposób Mendeliański przez danego założyciela. Założyciele mogą być mozaiką dla transgenu, jeśli integracja zachodzi po pierwszym podziale komórki. Mozaicyzm może skutkować częstością dziedziczenia mniejszą niż 50% u potomstwa pierwszego pokolenia. U niektórych założycieli transgen może integrować się z więcej niż jednym locus, co skutkuje częstością dziedziczenia przekraczającą 50%. W tym przypadku poziomy ekspresji wśród potomstwa pierwszego pokolenia mogą się różnić, w zależności od tego, które miejsce integracji dziedziczą.

mniej powszechnym problemem jest całkowita utrata transgenu, która może być spowodowana rekombinacją mejotyczną. Czasami ekspresja transgenu może być wyłączona w kolejnych pokoleniach z powodu metylacji, co może być związane z faktem, że większość transgenów jest wstawiana jako konkatem głowa-ogon zawierający wiele kopii transgenu. Obecnie oferujemy inne metody wytwarzania myszy transgenicznych, wykorzystujące rekombinację homologiczną w loci ROSA26 i H11, która eliminuje problemy związane z losowo wstawionymi transgenami. Zobacz naszą usługę ukierunkowanej Transgenezy.

jeśli stosuje się linię inbredową dawców jaj (tj. C57BL/6NJ), to założyciele powinni być hodowani na tym samym tle, aby utrzymać status inbredowy. W przypadku założycieli hybrydowego szczepu B6SJLF2 / J, klient musi zdecydować, czy przejść backcross do linii wsobnej,czy też utrzymać mieszane tło.

myszy z transgenem na jednym chromosomie są określane jako „hemizygotyczne”, ponieważ nie mają odpowiedniego allelu na drugim chromosomie. W wielu przypadkach możliwe jest wytwarzanie homozygotycznych transgeników, które mogą mieć wyższy poziom ekspresji niż odpowiadające im myszy hemizygotyczne, ale odróżnienie homozygotów od hemizygotów może być trudne. Należy zastosować ilościowy test genotypowania (np. ilościowy PCR lub Southern blotting). Alternatywnie, podejrzenia homozygoty można krzyżować na myszy typu dzikiego i wszystkie potomstwo badane w celu sprawdzenia, czy są one hemizygotyczne.

wreszcie, badacze powinni być świadomi, że w około 10% przypadków integracja transgenu wiąże się ze zmianami w strukturze genomu (tj. delecjami, insercjami, inwersjami), które mogą skutkować mutacją recesywną. Mechanizm leżący u podstaw tego zjawiska nie jest jasny, ale może obejmować fizyczne uszkodzenie zagęszczonej chromatyny przez igłę mikoinjekcyjną podczas iniekcji transgenu DNA.

do góry

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.