SRMAtlas Home

testele selectate/Multiple de monitorizare a reacțiilor, efectuate pe Instrumente triple quadrupole, pot fi cuplate la cromatografie lichidă pentru analiza digestelor proteomice complexe.

în testele SRM/MRM, primul (Q1) și ultimul (Q3) analizoare de masă ale unui spectrometru de masă triplu quadrupol sunt utilizate ca filtre de masă pentru a izola un ion peptidic și un ion fragment corespunzător. Semnalul ionului fragmentat este apoi monitorizat pe parcursul timpului de eluție cromatografică (Fig. 1). Selectivitatea rezultată din cele două etape de filtrare, combinată cu ciclul de funcționare ridicat, are ca rezultat analize cantitative cu sensibilitate și specificitate de neegalat. Perechile specifice de valori m / z asociate ionilor precursori și fragmentați selectați sunt denumiți „tranziții” și constituie efectiv teste spectrometrice de masă care permit identificarea și cuantificarea unei peptide specifice și, prin inferență, proteina corespunzătoare într-un digest complex de proteine.

Figura 1.

procesul de stabilire a unui test SRM/MRM pentru o proteină constă dintr-un număr de pași:
1. Selectarea peptidei / peptidelor adecvate, unice pentru proteina de interes și care prezintă un răspuns al semnalului de spectrometrie de masă mare (peptide proteotipice, PTPs), pentru a maximiza sensibilitatea testului
2. Selectarea fragmentelor peptidice predominante specifice peptidei de interes pentru a fi utilizate în tranziția MRM
3. În cele din urmă, pentru fiecare pereche peptidă-fragment, optimizarea parametrilor MS specifici (de exemplu, energia de coliziune) pentru a maximiza răspunsul/Sensibilitatea semnalului
4. Validarea testului MRM pentru confirmarea identității peptidelor, de exemplu prin obținerea unui spectru MS2 complet al peptidei în instrumentul triplu quadrupol utilizat pentru MRM
5. Extragerea „coordonatelor” finale ale testului MRM, inclusiv fragmentele peptidice și peptidice selectate, rapoartele masă-sarcină corespunzătoare, rapoartele de intensitate a fragmentelor, energia de coliziune asociată și timpul de eluție cromatografică care trebuie utilizat opțional în analizele MRM cu limită de timp

în general, acesta este un proces lung și iterativ, dar, odată stabilit un test MRM pentru o proteină, acesta devine universal util, adică. procesul obositor de dezvoltare a testului trebuie efectuat o singură dată, pentru un anumit tip de spectrometru de masă și mecanism de fragmentare (de exemplu, disociere indusă de coliziune).

în MRMAtlas, fiecare test proteic este prezentat ca un set de coordonate MRM optime pentru peptida(peptidele) care reprezintă o proteină. Identificările peptidice au fost validate prin achiziționarea spectrelor de masă tandem corespunzătoare pe spectrometrul de masă triplu quadrupol, care poate fi privit ca Spectre unice sau consensuale. Coordonatele finale ale testului pot fi descărcate direct în format de tabel Excel, care pot fi lipite direct într-o metodă MRM/SRM a unui instrument triplu quadrupol și utilizate pentru a detecta și cuantifica în mod specific proteina de interes într-un digest complex de proteine.

(adaptat de la: A. Schimdt, P. Picotti și R. Aebersold Proteomeanalyse und systembiologie BIOspektrum, 1/2008, S. 44)

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.