SRMAtlas hem

valda/multipla reaktionsövervakningsanalyser, utförda på trippel quadrupolinstrument, kan kopplas till vätskekromatografi för analys av komplexa proteomsmältningar.

i SRM/MRM-analyser används de första (Q1) och sista (Q3) massanalysatorerna av en trippel quadrupolmasspektrometer som massfilter för att isolera en peptidjon och en motsvarande fragmentjon. Signalen för fragmentjonen övervakas sedan över den kromatografiska elueringstiden (Fig. 1). Selektiviteten som härrör från de två filtreringsstegen, i kombination med den höga arbetscykeln, resulterar i kvantitativa analyser med oöverträffad känslighet och specificitet. De specifika paren av m / z-värden associerade med de utvalda prekursor-och fragmentjonerna kallas ”övergångar” och utgör effektivt masspektrometriska analyser som gör det möjligt att identifiera och kvantifiera en specifik peptid och, genom inferens, motsvarande protein i en komplex proteinsmältning.

Figur 1.

processen att upprätta en SRM / MRM-analys för ett protein består av ett antal steg:
1. Val av lämplig peptid/s, unik för proteinet av intresse och visar signalrespons med hög masspektrometri (proteotypiska peptider, PTP), för att maximera känsligheten för analysen
2. Urval av dominerande peptidfragment specifika för peptiden av intresse som ska användas i MRM-övergången
3. Så småningom, för varje peptid-fragmentpar, optimering av specifika MS-parametrar (t.ex. kollisionsenergin) för att maximera signalresponsen/känsligheten
4. Validering av MRM-analysen för att bekräfta peptididentitet, t.ex. genom att förvärva ett fullständigt MS2-spektrum av peptiden i Triple quadrupol-instrumentet som används för MRM
5. Extraktion av de slutliga ”koordinaterna” för MRM-analysen, inklusive de valda peptid-och peptidfragmenten, motsvarande mass-till-laddningsförhållanden, fragmentintensitetsförhållandena, den associerade kollisionsenergin och den kromatografiska elueringstiden som eventuellt ska användas i tidsbegränsade MRM-analyser

Sammantaget är detta en lång och iterativ process, men när en MRM-analys för ett protein har upprättats blir det universellt användbart, dvs. den tråkiga analysutvecklingsprocessen behöver endast utföras en gång för en given typ av masspektrometer och fragmenteringsmekanism (t.ex. kollisionsinducerad-dissociation).

i MRMAtlas presenteras varje proteinanalys som en uppsättning optimala MRM-Koordinater för peptiden(erna) som representerar ett protein. Peptididentifieringar har validerats genom att förvärva motsvarande tandemmasspektra på trippel quadrupolmasspektrometern, som kan ses som singel-eller konsensusspektra. De slutliga analyskoordinaterna kan laddas ner direkt i Excel-tabellformat som direkt kan klistras in i en MRM/SRM-metod för ett trippel quadrupolinstrument och används för att specifikt detektera och kvantifiera proteinet av intresse i en komplex proteinsmältning.

(anpassad från: A. Schimdt, P. Picotti och R. Aebersold Proteomeanalyse und Systembiologie BIOspektrum, 1/2008, S. 44)

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.